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多种分离方法取高质量的外泌体具体操作详解

发布人:上海源叶生物科技有限公司

发布日期:2022/3/7 9:52:12

近年来,生物学领域袭来一股“外泌体”研究热潮。从细胞的排泄“废物”到全球学者研究的“珍宝”,完成最强逆袭,一跃成为当下最炙热的关键词。随处可见的以外泌体为关键词的高分文章和相关产品,覆盖各大领域,同时具有非常不错的发展前景,得到国家各类科研基金以及市场资本的支持。


“外泌体”——最新动态

 

 


“外泌体”提取的方法

作为新兴研究领域,外泌体研究的技术方法从最初的不完善,正在走向标准化。国际细胞外囊泡学会(ISEV)分别在2014年和2018年发表了EVs的研究方法和质控标准。但EVs的分离和纯化是EVs相关基础研究和临床应用的瓶颈问题之一,国内外学者也在尝试不同分离与富集方法。不同研究目的对EVs的纯度要求不同,也就面临不同方法的选择,下面就几种常用的EVs分离与富集方法进行详细介绍。




超速离心法
 

超速离心法(Ultracentrifugation,UC)可以通过颗粒大小和密度两个不同的维度,单独或组合使用差速离心或密度梯度离心的方法来分离和富集EVs。根据全世界范围内的ISEV调查,差速超速离心法是最广泛使用的EVs分离纯化方法,被视为EVs提取的“金标准”。尽管可以通过差速或密度梯度离心来减少杂质污染,但工作量较大,需要专门离心设备等,在未来外泌体的诊断和治疗领域中不会作为首选的分离方法。

 

 


超滤法
 

超滤法(Ultrafiltration,UF)是一种相对快速和直接的技术。超滤特别适用于浓缩已通过其它方法分离的EVs,也可以用作主要的EVs分离/浓缩技术。超滤法使用的膜通常由纤维素、聚砜等材质制成,截留分子量为10-1000 kD。而超滤的一种高级形式就是切向流过滤(TFF),区别于传统的死端过滤。TFF是指液体流动方向与过滤方向垂直的过滤形式,切向流不断清洗冲刷膜表面,防止堆积,保持膜表面的清洁和持续工作。基于TFF的过滤原理和EVs的颗粒分布,切向流超滤(TFU)是目前快速分离EVs的主要方法之一。但TFU过程中膜容易堵塞,从而造成EVs的损失,该方法更适合从大体积样本中富集EVs。

 

图1 a)死端过滤;b)切向流过滤



尺寸排阻色谱法
 

尺寸排阻色谱法(Size-exclusion chromatography,SEC)是一种将溶液中的分子按照尺寸大小或者在某些情况下按照其分子量大小进行分离的色谱方法。SEC已经用于多种生物样本中EVs的分离制备,可单独使用或与其它分离方法搭配使用。研究表明,用SEC进行EVs分离,并与基于聚乙二醇(PEG)的EVs富集方法相结合,具有很好的重复性。目前市场上基于该原理的纯化管柱参差不齐,也给广大客户带来不同的选择和不同的实验结果。

 

图2 尺寸排阻色谱法原理示意图




沉淀法
 

沉淀技术在半个世纪前就应用于富集和提纯病毒颗粒,而EVs和病毒颗粒有相近的生物理化特性,根据溶解度将EVs与其它化合物分离。最常用的亲水多聚物沉淀法是PEG沉淀法,PEG亲水性强,有较广范围的分子量,优良的适应性和富集功能使其成为目前商品化EVs富集试剂开发的热点。

 




免疫亲和分离法
 

EVs的膜表面存在大量的标志物,利用免疫学中的抗原抗体作用及受体和配体之间的特异性反应,可将EVs有效地分离。目前基于免疫亲和性原理的EVs富集方法主要有免疫磁珠法和微流控技术。其中免疫磁珠法主要利用EVs膜上常见标志物(例如CD9、CD63、CD81等)以及其它肿瘤相关标志物等来特异性捕获与富集。微流控技术已经实现了对EVs的选择性分离纯化,基于EVs的物理和生物化学性质的微尺度分离。与其他方法相比,基于免疫亲和原理捕获的EVs纯度更高,利于自动化应用。

 


“组合”的方法成为趋势

荷兰学者通过收集近两年共计700篇论文中描述的所有892种不同EVs分离方法,包括单一和组合的分离方法,分别对不同来源样本进行统计分析。文章结果显示:约60%为组合的方法分离EVs,其中细胞上清和血清或血浆都存在6种以上的EVs组合分离方法。另外组合的方法在EVs产量和纯度方面整体上优于单一方法。该文分析,无论起始的样本的类型如何,组合方法分离EVs都显示了明显的优势。但不同研究目的也会催生研究人员选择不同的分离方法,已有报道称SEC与一种离心的方法相结合可以有效地从血清或血浆的样本中去除脂蛋白等杂质。且该文作者建议将SEC包括在EVs分离方法中,可提高EVs的纯度,同时会提高产量。

 

图3 不同生物样本单一和组合分离方法统计(左图);不同分离方法获得EVs的产量和纯度统计(右图)

 

备注:CCS:细胞培养上清液,LSC:低速离心法,PK:蛋白酶K处理,TEI:总外泌体提取试剂盒,PEX:外泌体纯化试剂盒, EQ:Exoquick沉淀法,IBMF:免疫微流控技术,EP:Exoprep沉淀法,EXE:exoEASY外泌体提取试剂盒。

 

每一年都有很多EVs相关的研究报道,包括基础功能研究、临床诊断或疾病治疗等,但没有对EVs分离方法进行评估,不同分离方法可能会导致实验结果不可重复或EVs质量差等。总之,没有单一的EVs分离方法适合所有EVs的研究目的,组合的EVs分离方法逐渐成为一种趋势。正确捕获高质量的EVs,提高实验研究的准确性和可靠性。

 

 

 

参考文献

 

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