结晶紫染色液：不只是“把细胞染成紫色”

• 革兰氏阳性菌： 在规范的染色流程中，通常保留结晶紫－碘复合物，呈紫色。

• 革兰氏阴性菌： 经脱色后通常失去主要的紫色初染，并在复染后呈粉红色或红色。

需要注意，结晶紫单独染色并不能完成革兰氏阳性菌与阴性菌的区分。真正决定最终判读的是包含媒染、脱色和复染在内的完整流程。

• 染色前的固定方式应符合具体实验方案；

• 清洗时应避免将细胞冲掉；

• 不同组之间应保持一致的染色与脱色条件。

结晶紫在这里主要用于显示保留下来的细胞，并不是直接、特异地标记某种细胞功能或迁移机制。

结果分析通常关注集落数量、大小或预先定义的计数标准。具体分析方式应根据实验设计统一设定，并设置合适的生物学重复。

死菌、胞外基质以及其他可被染色并保留的成分都可能影响读数。因此，如果研究目标是活菌数量、细胞活性或生物膜中的活菌比例，需要结合其他适用方法进行验证。

• 细菌涂片与固定：取适量细菌菌液，均匀涂布于洁净载玻片上，形成薄而均匀的菌膜。室温自然干燥后，采用热固定法固定菌体，避免过度加热。

• 结晶紫初染：滴加革兰氏结晶紫染液，使其完全覆盖菌膜，室温染色约1分钟。随后用缓慢水流轻轻冲洗，去除多余染液。

• 碘液媒染：滴加革兰氏碘液覆盖菌膜，室温作用约1分钟，使结晶紫与碘形成复合物。随后用清水轻轻冲洗。

• 脱色：使用95%乙醇或专用革兰氏脱色液进行脱色，通常以10–20秒作为初始参考，具体根据菌膜厚度及试剂说明书调整，或直至流下的乙醇无明显紫色。脱色后立即用清水冲洗，终止脱色。

• 番红复染：滴加番红复染液，室温染色约30–60秒，随后用清水轻轻冲洗。

• 干燥与检测：将载玻片自然干燥，使用光学显微镜油镜（100×物镜）观察。革兰氏阳性菌呈紫色或蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色或粉红色。

• 细胞处理与固定： 在培养板（如96孔板、24孔板或6孔板）中培养并处理细胞后，小心吸弃培养液。用1×PBS轻柔洗涤细胞1–2次，去除培养基及残留物。加入适量4%多聚甲醛（如100–200 μL/孔，具体根据培养板规格调整），室温固定10–15分钟。

• 染色： 吸弃固定液，用PBS或去离子水轻柔洗涤，随后加入0.1%的结晶紫水溶液，确保完全覆盖细胞，室温染色10–20分钟。

• 洗涤与干燥： 轻轻吸弃染液，用去离子水反复清洗3–5次，直至洗液基本无色，去除未结合的染料。将培养板完全风干。

• 结果观察： 使用倒置显微镜或成像系统观察细胞染色情况，比较不同处理组细胞的染色面积、分布及相对贴壁细胞数量。

• 染料溶解与定量（可选）： 如需进行吸光度定量，可采用经过验证的0.5%结晶紫（溶于20%甲醇）染色体系，室温染色约20分钟。清洗并充分干燥后，每孔加入适量溶解液，低速振荡约20分钟，使结合的结晶紫充分溶解。吸取各孔溶液，使用酶标仪在590 nm波长处测量吸光度（OD值）。

• 细胞接种与培养： 取对数生长期细胞，消化并制备单细胞悬液，计数后接种于6孔板中，常见接种量为200–1,000个细胞/孔。每组设置至少3个复孔，加入适量完全培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养约1–3周，具体时间根据细胞增殖速度调整，直至形成清晰且相互独立的细胞克隆。

• 细胞固定： 克隆形成后，小心吸弃培养液，避免破坏细胞集落。用1×PBS轻柔洗涤1–2次。可采用乙酸/甲醇混合固定液，加入适量固定液覆盖细胞克隆，室温固定约15–20分钟。

• 染色： 吸弃固定液，待培养板适当干燥后，加入0.5%结晶紫染液，确保覆盖整个培养区域，室温染色约20–30分钟。

• 洗涤与干燥： 吸弃染液，用去离子水轻柔清洗3–5次，直至背景基本干净。将培养板自然风干。

• 结果观察与分析： 使用成像系统拍摄各孔整体图像，记录紫色细胞克隆的数量及分布。通常将含有不少于50个细胞的集落定义为一个克隆，统计各组克隆数量，并计算克隆形成率。

• 细菌接种与生物膜形成： 将调整好浓度的细菌培养液加入无菌96孔平底聚苯乙烯培养板中，每孔加入约100–200 μL。设置培养基空白孔及实验对照孔，根据菌种特性，在适宜条件下静置培养，常见培养时间为24–48小时，使细菌附着于孔底并形成生物膜。

• 去除浮游菌： 小心吸弃孔内培养液，避免触碰孔底及附着的生物膜，去除未附着的浮游细菌。

• PBS清洗： 每孔加入约200 μL 1×PBS，轻柔清洗2–3次，去除残留浮游菌及培养基成分，避免生物膜脱落。

• 固定与干燥： 可选择采用甲醇固定，每孔加入约200 μL甲醇，室温固定约15分钟。吸弃固定液后自然晾干。

• 结晶紫染色： 每孔加入约125–200 μL 0.1%结晶紫染液，确保覆盖孔底，室温染色10–15分钟。

• 洗涤与干燥： 吸弃染液，用去离子水轻柔清洗3–4次，直至未结合的染料基本洗净。将培养板完全风干。

• 染料溶解： 每孔加入约125–200 μL 30%乙酸溶液，在摇床上低速振荡10–15分钟，使附着生物膜中的结晶紫充分溶解。

• 检测与分析： 将各孔溶解液转移至新的透明平底96孔板中，使用酶标仪在590 nm波长处测量吸光度（OD值）。使用相同浓度的乙酸溶液作为空白，扣除背景吸光度后，比较不同处理组的生物膜形成量。