Annexin V/PI 流式凋亡检测：原理、标准 SOP、四象限判读与常见问题排查

原理：

磷脂酰丝氨酸(PS)主要分布在细胞膜内侧，即与细胞质相邻的一侧。Annexin V（膜联蛋白-V）是一种分子量为 35~36 KD 的 Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，可与磷脂酰丝氨酸 (PS)选择性结合。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞表面，暴露在细胞外环境中。此时，使用带荧光探针的 Annexin V 与外翻的磷脂酰丝氨酸 (PS) 结合，就可用流式细胞仪或荧光显微镜直接检测到磷脂酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。

碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 是一种 DNA 结合染料，它可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞的细胞核，激发后呈现红色荧光。

Annexin V/PI原理示意图

详细流程（以流式细胞术为例）：

一 收集细胞

1.悬浮细胞：在进行完细胞凋亡刺激后，1000 rpm 离心 5 min，弃上清，收集细胞，用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。取 50~1×10⁶ 个重悬的细胞。

注意：PBS 重悬不能省略，PBS 重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续 Annexin V 的结合。

2.贴壁细胞：把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS 洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液（不含EDTA）消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，即可停止消化。加入上面收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000 rpm 离心5 min，弃上清，收 集细胞，用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。取 50~1×10⁶ 个重悬的细胞。

注意：EDTA能够蝥合Ca2+进而抑制AnnexinV与PS结合;

胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细 胞膜的损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳 性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V 的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。

二.染色

1.取 50~1×106 个重悬的细胞，1000 rpm 离心 5 min，弃上清，加入 100 µL 1 × Annexin V 结合缓冲液轻 轻重悬细胞。

2.加入Annexin V，轻轻混匀

3.加入 5 µL PI 染色液，轻轻混匀

4.室温 (20~25 ºC) 避光孵育 10~15 min。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞 2~3 次以改善染 色效果。

5.孵育完成后，可直接加入 400 μL 1 × Annexin V 结合缓冲液重悬细胞，立即上机检测。

注意：使用量根据自身使用试剂盒进行调整

三 结果分析

1. Q4 左下：AnnexinV⁻ PI⁻｜活细胞 细胞膜完整，PS在膜内侧，没有凋亡信号。正常对照组绝大多数细胞落在这。

2. Q3 右下：AnnexinV⁺ PI⁻｜早期凋亡 PS外翻（AnnexinV阳性），细胞膜还完整，PI进不去。这是真正的早期凋亡群体。

3. Q2 右上：AnnexinV⁺ PI⁺｜晚期凋亡 / 继发性坏死 PS外翻 + 细胞膜破损。凋亡走到晚期，膜通透性丧失，PI入核染色。 > 论文统计：总凋亡率 = Q3（早凋） + Q2（晚凋）

4. Q1 左上：AnnexinV⁻ PI⁺｜机械损伤/原发性坏死/细胞碎片 膜直接破了，但没有PS外翻。一般是消化吹打太猛、冻融、剧烈离心造成的人工损伤。

👉 Q1比例越高，实验越不可信，尽量控制Q1＜5%

常见问题：

Q1：流式凋亡为何左上象限出奇地高？

A1：左上象限一般是由于处理方式不当（机械力过大）、处理时间太久或刺激物浓度过高导致的环境骤变，引起非凋亡途径的细胞死亡。需要优化处理的浓度和时间梯度，并优化细胞培养和细胞消化的流程。

Q2：为什么凋亡结果与预期不符？

A2：处理时间过长、处理浓度过高、细胞初始活性差等原因导致的假阳性或假阴性结果。

Q3：为什么检测不到凋亡阳性信号？

A3：1.操作问题：EDTA 没洗干净、有残留；没有搭配含 Ca²⁺ 的 Binding Buffer 使用；加核酸染料后又进行了洗涤（正常操作是不洗涤直接上机）。

2.细胞处理问题：细胞初始活性差；外源刺激剂量不足；制备过量，做流式前没有做细胞计数和镜下观察。

做 Annexin V/PI 流式细胞凋亡检测，可选用 EnkiLife 凋亡检测试剂盒，配套优质特级胎牛血清、细胞培养全能补给包，保障细胞状态，减少消化、培养带来的人为坏死干扰，降低 Q1 象限假阳性，让凋亡流式结果更稳定可信。

EnkiLife 同时提供各类细胞试剂、抗体、蛋白、稳转细胞系构建、TSA 多重荧光、抗体标记等试剂与技术服务，助力凋亡及各类细胞功能研究。