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发布人：西安齐岳生物科技有限公司
发布日期:2026/11/3 16:56:21
DiSulfo-Cy5-NHS免疫标记信号弱？染料偶联比例怎么优化？
DiSulfo-Cy5-NHS ester（双磺酸化Cy5活性酯）用于抗体荧光标记时，信号较弱通常与NHS活性酯水解、抗体氨基反应效率不足、染料标记密度偏低或荧光自淬灭有关。该染料具有较好的水溶性，可通过NHS活性酯与抗体赖氨酸残基上的伯氨基发生酰胺化反应，形成稳定的荧光标记抗体。
对于偶联效率不足的问题，可优先选择pH 7.5—8.3的无伯胺缓冲体系，避免使用Tris等含氨基缓冲试剂。染料应在反应前新鲜配制，减少长时间水相暴露造成的活性酯水解。反应后可采用凝胶过滤或超滤去除游离染料，并结合紫外-可见吸收光谱计算染料与抗体的实际标记比（DOL）。
对于TR-FRET免疫检测，还应检查供体与受体之间的光谱匹配、抗体结合活性及检测通道。Cy5标记密度过高可能引起荧光自淬灭或影响抗原抗体结合，因此不能单纯通过增加染料用量解决信号不足的问题。
DiSulfo-Cy5-NHS偶联比例优化应区分染料投料摩尔比与最终实际标记比。前者是反应中染料与抗体的摩尔比例，后者是每个抗体分子实际连接的染料平均数量，两者并不完全相同。
对于常规IgG抗体，可从染料与抗体摩尔比3:1、6:1和10:1开展初步筛选，并设置相同的缓冲体系、温度和反应时间，比较不同条件下的标记效率、荧光强度及抗原结合活性。这些比例属于建议筛选梯度，最终需要根据抗体结构和检测体系确定。
实际标记比可利用Cy5最大吸收峰与280 nm蛋白吸收峰进行计算，并扣除染料在280 nm处的吸收贡献。标记完成后，还应比较游离染料残留、荧光背景及抗体免疫反应活性。
对于TR-FRET体系，建议同时检测620 nm供体通道与665 nm受体通道，并使用受体与供体信号比值评价检测表现。最适宜的染料偶联比例应以免疫检测信噪比、检测灵敏度和抗体结合性能为依据，而不是仅追求最高荧光强度。
2024年发表于Sensors的研究《Immunoassay System Based on the Technology of Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer》，建立了基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的免疫分析系统，用于降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）及白细胞介素6（IL-6）的检测。
该研究使用西安瑞禧生物提供的DiSulfo-Cy5-NHS ester作为荧光受体标记试剂，通过NHS活性酯与抗体氨基偶联，制备DiSulfo-Cy5标记抗体，并与铕配合物标记抗体共同构建TR-FRET免疫检测体系。
研究人员采用100 μg抗体，抗体浓度为1 mg/mL，溶解于pH 7.2—7.4的PBS缓冲液中，加入2 μL浓度为2 mM的DiSulfo-Cy5-NHS ester DMSO溶液，在37℃避光反应2小时。反应完成后，通过7 kDa凝胶过滤柱去除游离染料，获得DiSulfo-Cy5标记抗体。
若按照150 kDa的常规IgG分子量估算，该条件下染料与抗体的投料摩尔比约为6:1。该比例属于根据论文投料量计算的结果，并非论文测得的实际标记比。
【图1：论文Figure 1，TR-FRET免疫分析中供体与Cy5受体之间的荧光共振能量转移原理】
在免疫检测过程中，研究将70 μL抗原样品与100 μL检测试剂混合，在37℃孵育18分钟，分别采集620 nm和665 nm荧光信号，通过荧光强度比值计算抗原浓度。
实验结果显示，PCT检测范围为0.02—50 ng/mL，定量限为0.096 ng/mL；CRP检测范围为0—500 ng/mL，定量限为2.70 ng/mL；IL-6检测范围为0—20 ng/mL，定量限为2.82 ng/mL。
【图2：论文Figure 15、Figure 16，PCT、CRP及IL-6免疫检测标准曲线】
研究说明，DiSulfo-Cy5-NHS能够用于抗体荧光标记，并作为TR-FRET受体参与免疫分析。论文采用的标记条件为抗体荧光偶联提供了实验参考，但并未系统比较不同染料投料比例的优劣。
西安瑞禧生物可提供DiSulfo-Cy5-NHS ester及相关水溶性荧光染料定制，支持蛋白质标记、抗体荧光偶联、免疫检测及分子生物学研究。
DiSulfo-Cy5-NHS ester：支持抗体、蛋白质及含氨基生物分子的荧光标记。
Cy5-NHS、Cy5.5-NHS、Cy7-NHS：提供不同荧光波段的活性酯染料。
水溶性荧光染料：支持Sulfo-Cy系列染料及不同反应性基团的功能化定制。
双功能PEG连接臂：可提供NHS-PEG-MAL、NHS-PEG-NH2等功能连接材料。
蛋白及抗体荧光偶联：支持根据目标蛋白性质设计染料偶联比例、反应条件和纯化方案。
结构与质量表征：可根据项目需求开展HPLC、质谱、紫外-可见吸收及荧光光谱检测。
针对DiSulfo-Cy5-NHS免疫标记信号弱、游离染料背景高及抗体标记密度不稳定等问题，可结合染料结构、抗体浓度、反应pH和目标检测体系进行材料定制与标记方案优化，为TR-FRET免疫分析及荧光生物检测提供功能化染料支持。
Xu Z, Zhou H, Li L, et al. Immunoassay System Based on the Technology of Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer. Sensors, 2024, 24(5): 1430.
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