一文读懂流式细胞术，最全攻略来咯

发布人：上海信裕生物科技有限公司

发布日期:2026/11/2 10:48:26

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。

流式细胞术的基本原则

使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测。
针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态。
对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液。
对石蜡包埋组织应先切成若干40-50um厚的蜡片，经二jiaben脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞悬液。
单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。

常用的流式细胞术实验

PI 染色操作步骤

将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清液。
加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
离心，弃上清液。
用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤

将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清液。
加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
离心，弃上清液。
用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤

将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。
以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
离心，弃上清液。
加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤

将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。
以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心，弃上清。
BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。
PBS 1ml离心洗涤2次。
将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。

胞内直接免疫荧光染色操作步骤

将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
4%PFA 1ml，4℃固定30min。
用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
0.1% Triton-100 1ml, 室温10min。
用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul，用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
离心，弃上清液。
加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

胞内间接免疫荧光染色操作步骤

将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
4%PFA 1ml，4℃固定30min。
用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
0.1% Triton-100 1ml, 室温10min。
用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
加入用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心，弃上清液。
冷PBS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
加入PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。
冷PBA1ml离心洗涤2次。
将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。

注：

1、RNase A：贮液浓度：1mg/ml；

工作液配制：加1mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为 20ug/ml。

2、PI：贮液浓度：2.5mg/ml；

工作液配制：加2.5 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为 50ug/ml。

3、PBA：即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0.1%叠氮钠。

4、检测样品细胞浓度1x10^6/ml。

影响流式细胞术结果的有以下因素

样品处理，去除杂细胞、碎片等对正常细胞的计数;
对照:设立负对照、同型对照、弱阳性对照，帮助正确判断阴阳的界定;
正确的补偿;
正确的染色方法，抗体的比例，染色步骤，固定等都会影响结果，虽然有的影响很小;
抗体的搭配，主要是荧光素的搭配，以及好的克隆号;
机器的校验，但通常很少有人会天天校正机器;
对细胞的处理，这里说的是培养的细胞。比如培养前数目是否一致，药物量是否有可比性。

流式的缺点：移植性，机器、抗体、操作者等不同会影响结果，说明它的标准性欠缺，对人员有一定要求。

注：本文仅供阅读，不代表企业及作者立场。