杂交瘤细胞融合后集落少？杂交瘤细胞培养基与集落形成率的关系

杂交瘤细胞融合后集落少？杂交瘤细胞培养基与集落形成率的关系

摘要：融合后第14天计数96孔板集落数，是判断杂交瘤细胞培养基是否合适的直接指标。本文对比三种培养条件的集落形成率数据。

关键词：杂交瘤细胞融合、集落形成率、杂交瘤细胞培养基、杂交瘤细胞、饲养层培养基、细胞生长补剂、HAT筛选、Hybriboost

细胞融合只是起点。真正决定后续能否筛到阳性克隆的，是融合细胞在96孔板里长出多少个集落。集落数太少，后面的抗体检测就无从谈起——孔里没有细胞，再灵敏的ELISA也读不出信号。

一项对比实验把新融合的PEG杂交瘤细胞接种到96孔板，分三组培养：常规FCS培养基、含饲养层的FCS培养基、添加Hybriboost促杂交瘤细胞生长剂的FCS培养基。融合后第14天计数每板集落数，NS-1与SP2/0两种融合伴侣各做4次独立融合。三组之间除培养条件外，细胞批次、血清批次、铺板密度与操作人均相同。

以NS-1为例，Hybriboost组每板约900–1500个集落，饲养层组约130–250个，常规FCS组约70–120个。SP2/0体系的趋势一致，集落数略低，但组间排序不变。四次独立实验的结论方向一致，说明差异不是单次操作的偶然波动。

图1 三种培养基中杂交瘤融合后的集落数（NS-1、SP2/0，4次独立实验；数据来自研发方验证实验）

集落形成率的差距，来自细胞在筛选压力下的存活能力。基础培养基提供氨基酸、维生素与能量底物，这些是够不够用的问题；而新融合细胞面对的是HAT的代谢压力与低密度接种的双重不利，缺的是生长支持信号。饲养层细胞通过释放因子部分补上这一块，所以优于常规培养基；化学成分限定的补剂则把支持成分以确定浓度直接加入，省去了制备饲养层的步骤，也避免了批次差异。

计数方法本身也会影响结论。集落大小不一，多大算一个集落要在实验前规定清楚；选在融合后第14天计数，是因为此时集落已可辨，又未因过度生长而连成片。同一实验由同一人计数，可以减少主观偏差。若多块板一起计数，建议打乱处理顺序，避免先入为主。

不同实验室的具体数值会有差异，但组间排序通常稳定。影响集落数的因素包括融合效率、脾细胞活率、铺板密度与血清批次；这些条件在四次实验中保持一致，所以三组之间的差距可以归因于培养条件本身。若自己的实验里三组排序发生逆转，应先核查对照组的条件是否被改动。

如果自己的实验里集落数低于上述区间，先不必急着换配方。可以核三件事：铺板密度是否与方案一致、HAT是否在铺板当天加入、血清批次是否更换过。这三项里任何一项变化，都足以让集落数掉一个量级。核完再看培养体系本身。

还有一点需要分清：集落数是过程指标，阳性克隆数才是结果指标。前者反映有多少细胞活过了筛选，后者取决于免疫效果与抗体检测的灵敏度。两者相关，但不能互相替代。因此在评估一款培养基时，把集落数与后续阳性克隆数一起记录，比只看其中一项更接近实验目的。记录时注明计数日期与判定标准，也方便不同批次的实验互相比较。

上海曼博生物可提供Hybriboost促杂交瘤细胞生长剂及融合集落计数、培养基比对方案的技术支持（点击查看）。该产品仅面向科研用途，不得用于人体临床诊断或治疗。