蛋白质免疫印迹 (Western blot,WB)实验

该技术最早由斯坦福大学George Stark团队在1979年开发，1981年由Neal Burnette在学术刊物中正式命名，命名方式借鉴了此前针对DNA的Southern blot、针对RNA的Northern blot技术命名逻辑。它的核心原理是利用电场驱动经SDS-PAGE分离的多肽从凝胶转移到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，再通过目标蛋白的特异性一抗结合、标记二抗信号放大，最终通过显影扫描完成蛋白的鉴定与表达量分析，兼具SDS-PAGE的高分辨力和免疫检测的高特异性与敏感性。

①.样本获取:组织或细胞取材;

②.蛋白裂解:从组织或者细胞中释放获取蛋;

③.蛋白定量:获悉蛋白浓度，为后续电泳步骤提供上样量依据;

④.蛋白变性:使蛋白变性形成线性结构，方便跑胶和抗体结合。

第二步：凝胶上样、电泳

①.凝胶制备

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

它有两种形式:SDS-聚丙烯酰胺凝胶+(SDS-PAGE)及非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲又双丙烯酰胺+聚合而成，形成一个三维网状的结构，它具有分子筛效应。

②.上样与电泳

a)蛋白预染Marker*:采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，为了便于观察电泳效果与转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准。根据待测蛋白的分子量大小，挑选合适的Marker。

b)加入足量的样品:SDS-PAGE根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-30ug总蛋白或100ng纯蛋白;对于组织，我们通常建议上样量最多100ug总蛋白，具体取决于靶标表达水平;但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能还需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。

c)尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，方便后续观察蛋白的表达量。

d)空置的泳道用等体积的1xLoadingBuffer补齐，防止最后的一两个样品条带上扬。

第三步：转膜

①.转膜的原理

蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。蛋白质从凝胶向膜转移的过程常采用电转印法包括湿转和半干转，与SDS结合的蛋白带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。

②.膜的选择

灵敏度和分辨率、背景、结合能力、材料质地、溶剂耐受性、操作程序、检测方式、适用范围以这些数据做选择，常用的转印膜主要是PVDF膜、NC膜这2种，PVDF膜可以提供更好的蛋白截留率、物理强度和广泛的化学兼容性。

③.转膜的方法

湿转、半干转、干转，其中湿转是转膜最完全、应用最广的方法。

④转膜应注意的事项

1.大分子量蛋白:转膜缓冲液里加入0.1%的SD5;甲醇浓度降到10%甚至更少，用4°C湿转过夜代

2.小分子量蛋白:去净缓冲液里的SDS;保持甲醇浓度在20%;用小孔径的膜;降低转膜时间、电流/电压;

3.膜的方向确定:转移后剪角做标记，分清正反面;用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的;

4.转膜后背景高:选择NC膜;

5.转膜时污染:避免手指触碰膜，可以用镊子来取膜，油脂和蛋白质会弄脏膜;

6.滤纸的大小:确保滤纸和膜的大小与胶一致，当使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。

第四步：膜封闭

①.封闭的目的

转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭将会导致印迹膜出现比较高的背景，因为很多检测探针也是蛋白，也会与膜结合。

②.封闭液如何选择

通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白(BSA)和脱脂奶粉。般来说，脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时BSA比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

脱脂奶粉:性价比较高;通常使用浓度为2.5%~5%;不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。

牛血清蛋白(BSA):通常使用浓度为2%~5%;某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号，确定抗体使用的特殊需求，选择适当的封闭剂。

第五步：抗体孵育

①.孵育原理

一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。

②.抗体如何选择

1.文献引用:根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。

2.反应性:根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。

3.实验应用:根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。

4.抗体偶联物:标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶(AP)标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。

③.抗体孵育、洗涤注意事项

一抗孵育、洗涤:

a.将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释;

b.封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4°C过夜。

c.一抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次;

二抗孵育、洗涤:

a.一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释;

b.洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h;

c.二抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次。

第六步：ECL显影

①.显影的原理

显色的原理是实验中的二抗被HRP(辣根过氧化物酶)标记，可采用增强化学发光法(ECL)。

ECL灵敏度高、重复性好，是目前主流的WB显色方法。

②.显影的具体步骤

1.在避光环境中，将ECL化学发光试剂A液、B液1:1配置，充分混匀;

2.将PVDF膜置于化学发光成像仪载物台上;

3.用移液器吸取适量ECL混合液滴在PVDF膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;

4.推入载物台，设置曝光时间进行图片采集(可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

误区一：“没条带就是蛋白没提出来。”

不一定。也可能是变性失败、转膜方向装反、抗体不识别你的物种、显影时间太短，或目标蛋白在该组织里本身表达量极低。要先做阳性对照（已知高表达样本）排除系统问题，再怀疑样本本身。

误区二：“背景脏就多洗几遍。”

多洗确实有用，但治标不治本。背景脏的常见根因是封闭不足、抗体浓度过高、或一抗非特异结合。盲目多洗可能把真信号也洗淡。正确的做法是逐项排查：降低抗体浓度、延长封闭时间、优化洗膜次数。

误区三：“条带分子量不对就是跑错了。”

分子量不匹配可能是蛋白存在修饰（如磷酸化、糖基化改变表观分子量）、剪切异构体，或胶浓度/marker的问题。先查数据库确认该蛋白是否存在已知修饰或异构体，再怀疑操作。

误区四：“WB能定量，所以数据很硬。”

WB是半定量，线性范围有限，曝光过度会饱和失真。真正严谨的做法是保证目标条带落在曝光线性区间，必要时做灰度分析并用内参校正，不能只凭“看着亮不亮”。

第一步，判断是系统问题还是样本问题。

同时跑一个已知高表达的阳性对照。如果阳性对照也没有条带，说明是流程问题（抗体、转膜、显影），不是你的样本问题。如果阳性对照正常、你的样本没条带，再怀疑样本制备或表达量。

第二步，看信号“没有”还是“太脏”。

没信号，优先查：抗体是否识别该物种、是否过期、孵育时间够不够、显影试剂是否失效；背景太脏，优先查：封闭是否充分、一抗浓度是否过高、洗膜是否够。把“没有”和“太脏”当成两个独立问题分别排查，不要混在一起。

第三步，看条带“多”还是“歪”。

出现多条带，可能是非特异结合、蛋白降解或修饰；条带歪扭，多半是胶或转膜问题。条带多而杂，先降低抗体浓度、延长封闭；条带歪，检查上样是否垂直、胶有没有漏、转膜是否平整。

第四步，量化前先问“能不能比”。

只有曝光在线性区间、内参稳定、组间上样量一致，条带亮度才可比。先肉眼判断组内一致性，再用灰度软件（如ImageJ）做定量，报告相对值而非绝对值。

WB之所以让无数人抓狂，恰恰因为它把“一个结果”拆成了六步，每一步都是一个小变量。但也正因如此，它是最适合建立“实验直觉”的技术——你会慢慢学会从条带上读信息，从背景里找线索，从一次失败里同时排除掉好几类可能。

真正能提升WB成功率的，不是某支“神奇抗体”，而是你手里那套稳定的流程和判断框架。样本规范、定量准确、抗体靠谱、细节到位，剩下的交给时间去沉淀。