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发布人：西安齐岳生物科技有限公司
发布日期:2026/10/22 14:16:04
外泌体载药后如何判断药物是否进入细胞质？FITC荧光示踪与内涵体共定位实验怎么设计？
外泌体载药是纳米药物递送研究的重要方向，但外泌体被细胞摄取，并不代表所包载的药物已经成功进入细胞质。在实际实验中，药物可能被限制在早期内涵体、晚期内涵体或溶酶体中，导致细胞内药物积累量增加，却无法有效到达预期作用部位。
因此，评价外泌体递送效率不仅需要检测细胞摄取量，还应结合荧光标记药物、细胞器共定位、内吞通路分析及细胞内药物分布实验，区分细胞摄取、内涵体滞留与细胞质递送。
西安瑞禧生物提供的FITC标记顺铂（FITC-Cisplatin，cis-FITC）已应用于外泌体介导的药物细胞内递送研究。
2022年《Frontiers in Medicine》发表的研究《Exosome Mediated Cytosolic Cisplatin Delivery Through Clathrin-Independent Endocytosis and Enhanced Anti-cancer Effect via Avoiding Endosome Trapping in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer》，在实验材料部分明确记载，FITC标记顺铂购自西安瑞禧生物。
该研究以牛奶来源外泌体作为顺铂递送载体，通过FITC标记药物、PKH荧光膜标记、Rab5早期内涵体染色和LysoTracker溶酶体染色，分析顺铂耐药卵巢癌细胞A2780CP中的药物摄取及细胞内定位。
研究发现，外泌体介导的顺铂递送主要涉及网格蛋白非依赖性内吞及大胞饮作用，并表现出较低的内涵体、溶酶体共定位和更弥散的细胞内荧光分布，为评价外泌体药物递送及内涵体滞留提供了具体实验依据。
在这项研究中，FITC标记顺铂的主要作用是使药物具有可观察的绿色荧光信号，从而帮助科研人员分析药物进入细胞后的空间分布。
研究人员首先从牛奶中分离外泌体，再将顺铂或cis-FITC包载于外泌体中，分别构建用于药效评价和细胞内定位分析的实验体系。
需要区分两种不同的荧光示踪方式。
1. PKH26及PKH67标记外泌体膜
研究通过PKH26和PKH67等膜染料标记外泌体，用于观察外泌体与细胞的相互作用，以及不同内吞通路对外泌体摄取的影响。
这类染料主要报告被标记的膜相关组分，而不能单独证明药物已经释放进入细胞质。
2. FITC标记顺铂用于药物定位
研究将西安瑞禧生物提供的cis-FITC装载至牛奶外泌体中，得到milk-exosome/cis-FITC体系。
与直接使用游离cis-FITC相比，外泌体递送组可以用于分析载体对药物细胞内分布的影响。
通过结合细胞器标记和共聚焦显微成像，可以判断荧光标记药物与内涵体、溶酶体的空间关系。
该研究说明，荧光标记药物与荧光标记外泌体的实验目的不同。如果需要判断药物是否进入细胞质，应优先采用能够追踪药物本身的标记策略，并结合细胞器定位和独立药物定量实验进行验证。
外泌体递送通常涉及三个不同阶段。
外泌体可能首先与细胞膜结合。此时即使显微镜观察到明显荧光，也不能确认其已经完成内吞。
需要通过充分洗涤、细胞膜定位分析和必要的表面荧光淬灭对照，减少膜表面吸附信号的干扰。
外泌体可以通过不同内吞途径进入细胞，其中部分物质会随胞内运输过程进入内涵体和溶酶体。
此时能够观察到细胞内荧光斑点，但药物仍可能滞留在膜性细胞器内。
对于具有细胞质或细胞核作用靶点的药物，载体摄取之后还需要完成有效的药物释放与胞内转运。
如果荧光标记药物不再明显局限于内涵体，而是在细胞内部出现更弥散的分布，并且相应的细胞质药物定量或功能检测获得支持，则可以更有依据地判断其实现了细胞质递送。
因此，外泌体载药后的实验评价应分为以下三类：
| 评价目标 | 主要检测方法 | 结果说明 |
|---|---|---|
| 外泌体被细胞摄取 | PKH标记、共聚焦、流式细胞术 | 判断细胞相关摄取信号 |
| 药物是否发生内涵体滞留 | cis-FITC与Rab5、LysoTracker共定位 | 判断药物与相关细胞器的空间重叠 |
| 药物是否进入细胞质 | 三维成像、细胞质组分定量、功能检测 | 进一步验证药物递送位置和有效性 |
不能单纯根据细胞内绿色荧光增强，就认定药物已经成功从内涵体释放。
FITC荧光示踪实验的关键是确保荧光信号能够合理代表目标药物，而不是游离染料或其他标记组分。
对于顺铂相关研究，可以根据实验需求选择经过适当结构确认的荧光标记衍生物。
FITC标记后应关注荧光光谱、产物纯度及标记结构稳定性。
还应注意，FITC修饰可能改变原始药物的理化性质。因此，cis-FITC适合用于分析标记药物的胞内分布，但不能未经验证就认为其与未标记顺铂具有完全相同的转运和药效特征。
原论文利用牛奶来源外泌体构建顺铂递送体系，并通过色谱方法评价载药情况。
研究报告的顺铂装载能力为18%，同时对载药前后的外泌体进行形貌、粒径及特征蛋白表征。
对于FITC标记药物体系，纯化时应重点去除未装载的游离荧光药物，避免游离药物进入细胞后造成错误的定位判断。
原论文的milk-exosome及milk-exosome/cis主要分布在30—150 nm范围，并通过TEM、颗粒跟踪分析及Western blot进行表征。
论文检测了CD63、Alix和Tsg101等外泌体相关蛋白。
对于新的外泌体载药项目，应综合使用粒径、颗粒浓度、形貌、蛋白标志物及污染物评价，确认载药前后材料特征，并关注不同制备批次的一致性。
图2：牛奶外泌体与顺铂载药外泌体的TEM形貌、NanoSight粒径分布以及Alix、Tsg101、CD63蛋白表征
如果实验目标是判断顺铂是否被限制在内涵体或溶酶体中，可以采用cis-FITC结合Rab5、LysoTracker进行共聚焦分析。
原论文使用顺铂耐药卵巢癌细胞A2780CP。
实验中，科研人员在含盖玻片的24孔板中培养细胞，并通过适当的细胞密度和培养时间，使细胞达到适宜成像状态。
对于不同肿瘤细胞或其他细胞类型，需要重新优化药物处理浓度、孵育时间和细胞状态。
建议设置以下实验组：
未处理细胞：用于检测细胞自发荧光背景。
游离cis-FITC组：观察无外泌体递送时药物的细胞内定位。
外泌体/cis-FITC组：观察外泌体介导的药物定位变化。
空白外泌体组：评价载体自身的背景和细胞影响。
必要的游离染料对照：排除未结合FITC造成的信号干扰。
不同实验组应尽量按照相同药物当量比较，并确认FITC标记程度及游离染料残留情况。
Rab5是一种常用于早期内涵体研究的蛋白标志物。
原论文采用Rab5一抗及Alexa Fluor 594标记二抗进行免疫荧光检测，使早期内涵体呈现红色荧光。
通过观察绿色cis-FITC信号与红色Rab5信号的空间重叠程度，可以评价标记药物与早期内涵体之间的定位关系。
研究采用LysoTracker Red标记溶酶体相关酸性区室。
原论文在固定细胞前，以37 ℃孵育1 h完成相关染色，随后进行样品处理和共聚焦成像。
应注意，LysoTracker主要反映酸性细胞器，因此对于需要更完整评价晚期内涵体及溶酶体结构的实验，也可以结合Rab7、LAMP1等标记物进行分析。
该研究的主要荧光通道包括：
绿色：cis-FITC。
红色：Rab5或LysoTracker Red。
蓝色：DAPI标记细胞核。
进行共聚焦成像时，应分别设置激发和检测窗口，开展单染对照，避免FITC和红色荧光信号之间的串扰。
在比较不同实验组时，应保持激光功率、检测增益及图像分析方法一致。
原论文Figure 8是评价顺铂胞内分布最重要的实验图之一。
研究比较了游离cis-FITC与外泌体包载cis-FITC两组的细胞内定位。
在游离cis-FITC处理组中，绿色荧光与Rab5标记的早期内涵体具有较高空间重叠。
论文报告，cis-FITC与内涵体的Manders共定位系数达到0.82。
同时，cis-FITC与LysoTracker标记的溶酶体也存在较高重叠，共定位系数达到0.71。
这些结果支持游离cis-FITC在该细胞模型中存在明显的内涵体和溶酶体相关滞留现象。
在milk-exosome/cis-FITC组中，绿色荧光与Rab5及LysoTracker信号的重叠程度明显降低。
研究观察到较多分布于细胞内部、未明显集中于所标记内涵体及溶酶体的绿色荧光信号。
这些结果支持外泌体介导的药物递送有助于减少被标记内涵体和溶酶体区室的滞留。
但需要注意，低共定位并不自动证明全部药物已经进入细胞质。还需要结合标记物覆盖范围、荧光探针稳定性及独立的药物定位实验进一步确认。
图3：游离cis-FITC与牛奶外泌体包载cis-FITC在A2780CP细胞中的共聚焦定位结果
在药物与细胞器共定位研究中，不能只根据合并图片中的黄色荧光区域判断重叠程度，还需要通过定量方法分析。
Pearson相关系数用于评价两个荧光通道像素强度变化的相关性。
当绿色药物信号与红色细胞器标记信号在空间分布上具有较高相关性时，Pearson相关系数通常较高。
Manders系数主要用于描述一个荧光通道中与另一个通道重叠的信号比例。
在分析cis-FITC与内涵体定位时，可以使用经过背景扣除与阈值处理的图像，计算FITC信号与Rab5或LysoTracker的共定位程度。
需要注意，Manders分析具有方向性，应说明具体计算的是绿色信号与红色信号的哪一种重叠比例。
建议使用ImageJ或Fiji等软件，统一完成背景扣除、细胞区域选择、阈值处理和共定位系数计算。
同时应进行多个细胞和独立实验重复，不宜仅选择一张代表性显微照片作为定量依据。
对于需要评价外泌体内涵体逃逸效果的项目，可以同时报告共定位系数、细胞内荧光分布和细胞质药物定量结果。
外泌体药物递送研究中，经常将低Rab5共定位或低LysoTracker共定位解释为内涵体逃逸。
这种结果可以作为支持证据，但如果需要证明药物真正到达细胞质，应增加更直接的实验。
1. 三维共聚焦成像
通过Z-stack采集不同焦平面图像，并进行三维重建，观察荧光标记药物是否分布在细胞内部的非内涵体区域。
原论文采用三维重建分析，比较了游离cis-FITC与外泌体递送组的空间分布。
研究发现，外泌体递送组表现出更明显的弥散分布，与二维共定位结果相互支持。
图4：外泌体递送和无外泌体递送条件下cis-FITC在A2780CP细胞中的X、Y、Z方向三维空间分布，用于辅助分析药物的细胞内定位
2. 细胞质组分分离与药物定量
对于顺铂等含金属元素的药物，可以在验证细胞组分分离纯度的基础上，使用适宜的元素分析方法测定细胞质组分中的铂含量。
例如，结合ICP-MS测定细胞质与相关细胞器组分中的铂分布，有助于验证药物是否进入非膜性胞内空间。
应通过相应细胞器标志物检查分离组分的纯度，避免因细胞器破裂或交叉污染导致结果偏高。
同时，铂元素含量不完全等同于完整、具有活性的顺铂含量，必要时还需结合药物形态分析。
3. 内涵体膜完整性评价
针对需要研究内涵体破裂或膜通透性变化的体系，可以考虑Galectin-8募集分析等方法。
但并非所有细胞质递送都必须伴随明显的内涵体膜破裂，因此这类实验结果应与药物本身的定位证据结合解释。
4. 细胞内药物作用评价
对于顺铂，可以通过细胞内铂分布、DNA损伤或相关药效指标辅助验证药物的功能性递送。
细胞毒性提高本身不能单独证明内涵体逃逸成功，但与细胞质定位及药物定量结果一致时，可以增强整体结论的可信度。
原论文不仅研究了药物定位，还对外泌体进入A2780CP细胞的途径进行了分析。
研究采用PKH67标记牛奶外泌体，并通过内吞抑制剂及相关蛋白敲低实验比较摄取变化。
研究使用Cytochalasin D、Chlorpromazine、Genistein、Simvastatin和EIPA等试剂，从不同细胞过程角度干预摄取行为。
结果显示，Cytochalasin D、Genistein、Simvastatin和EIPA处理后，外泌体摄取信号降低。
而Chlorpromazine处理并未引起同样明显的摄取抑制。
这一结果支持该模型中的外泌体摄取更多涉及网格蛋白非依赖性内吞和大胞饮作用。
图5：不同内吞相关抑制剂处理后的PKH67标记外泌体共聚焦摄取图像及摄取量定量结果
研究进一步通过RNA干扰分析CAV1、ARF6、Rac1和CLTC等蛋白的作用。
结果发现，敲低CAV1、ARF6及Rac1后，外泌体摄取受到抑制；而敲低CLTC未产生同等程度的影响。
这一结果与抑制剂实验相互支持，说明外泌体摄取可能主要涉及网格蛋白非依赖性途径及大胞饮过程。
需要强调的是，内吞抑制剂和蛋白敲低分析反映的是细胞摄取机制，不能直接等同于药物已经完成内涵体逃逸。
FITC荧光实验的可靠性受到标记物性质、成像条件和图像分析方法共同影响。
| 常见问题 | 可能原因 | 优化方法 |
|---|---|---|
| FITC荧光较弱 | 标记量不足、环境pH变化、光漂白 | 检查光谱、标记程度及成像条件 |
| 细胞内背景较高 | 游离标记物残留、非特异性吸附 | 加强纯化并设置空白对照 |
| 荧光信号集中成点 | 内涵体滞留、载体聚集或局部富集 | 增加细胞器共定位及Z-stack分析 |
| 两种荧光严重串扰 | 检测窗口设置不合理 | 使用单染对照优化采集通道 |
| 不同批次结果差异大 | 载药量、颗粒浓度及标记程度不一致 | 统一材料质量与给药当量 |
| 共定位系数波动大 | 背景扣除和阈值处理不一致 | 固定分析流程并增加独立重复 |
| 共定位较低但药效不明显 | 药物未有效释放、标记与药物行为不同 | 增加细胞质药物定量及功能验证 |
FITC本身具有一定的环境敏感性，因此在分析细胞内荧光强度变化时，不能忽略酸性区室、载体微环境和荧光漂白对信号的影响。
西安瑞禧生物提供的cis-FITC已在牛奶外泌体递送顺铂的研究中得到实际应用。该研究直接展示了荧光标记小分子药物在细胞摄取、内涵体定位和胞内转运研究中的价值。
针对外泌体载药及细胞内定位实验，瑞禧可围绕荧光标记药物、功能化分子及相关纳米递送材料开展定制需求沟通。
围绕顺铂及其他适合进行荧光功能化研究的小分子，可根据具体结构评估标记位点、连接方式和产物纯化要求。
对于cis-FITC等材料，建议重点明确结构表征、纯度、荧光光谱和稳定性要求。
根据研究需要，可围绕FITC及其他荧光染料与小分子、蛋白质、多肽等材料的连接方式，确定相应功能化方案。
对于需要进行多通道共聚焦实验的项目，还应考虑荧光波段匹配和检测串扰问题。
针对外泌体膜示踪、药物示踪及细胞器共定位实验，可以根据研究对象明确荧光标记位置、染料形式和对照材料需求。
对于需要完整外泌体载药及递送验证的项目，应进一步确认外泌体来源、药物装载、纯化、粒径表征和功能实验是否包含在具体服务范围内。
对于脂质体、聚合物纳米颗粒及其他细胞内递送载体，可结合FITC标记、表面功能化及胞内示踪要求，沟通材料选择和定制设计。
需要明确的是，提供FITC标记药物和开展完整的内涵体逃逸机制研究属于不同工作内容，应根据项目实际需求分别确定材料、实验和交付范围。
不能。外泌体可能被细胞内吞后停留在内涵体或溶酶体中。需要结合药物标记、细胞器共定位和细胞质组分定量判断。
标记外泌体主要追踪载体相关信号，标记药物主要追踪药物相关信号。对于判断药物是否进入细胞质，应优先获得能够直接反映药物分布的证据。
两者反映的细胞器特征不同。Rab5主要用于早期内涵体分析，LysoTracker主要用于酸性细胞器示踪。根据实验条件，可以分组检测，并结合Rab7或LAMP1获得更完整的胞内转运信息。
在实验条件一致且荧光标记有效的前提下，较低的共定位可以支持较少的细胞器滞留，但不能单独证明完整药物已释放进入细胞质。
2022年《Frontiers in Medicine》的牛奶外泌体顺铂递送研究明确使用瑞禧提供的cis-FITC，结合Rab5、LysoTracker及共聚焦显微成像，研究药物在顺铂耐药卵巢癌细胞中的胞内分布。
外泌体载药后的实验评价不能停留在细胞摄取阶段，还需要进一步判断药物是否被限制在内涵体、是否发生细胞内重新分布，以及能否到达预期作用部位。
2022年《Frontiers in Medicine》发表的研究采用西安瑞禧生物提供的FITC标记顺铂，结合牛奶外泌体递送、Rab5早期内涵体标记、LysoTracker溶酶体染色、共定位分析及三维成像，发现外泌体递送组具有更低的内涵体相关共定位和更弥散的细胞内荧光分布。
研究还通过内吞抑制剂和蛋白敲低实验，支持网格蛋白非依赖性内吞与大胞饮作用参与外泌体摄取过程。
对于外泌体载药、荧光标记小分子药物及细胞内定位研究，西安瑞禧生物可围绕FITC标记药物、荧光功能化及相关纳米递送材料提供科研定制方案支持。
通过将材料质量控制、荧光共定位、细胞质药物定量与生物学功能实验结合，可以更可靠地评价外泌体载药体系的细胞内递送表现。
[1] Zhou G, Gu Y, Zhu Z, et al. Exosome Mediated Cytosolic Cisplatin Delivery Through Clathrin-Independent Endocytosis and Enhanced Anti-cancer Effect via Avoiding Endosome Trapping in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer. Frontiers in Medicine, 2022, 9: 810761.
DOI：https://doi.org/10.3389/fmed.2022.810761
论文原文：https://www.frontiersin.org/journals/medicine/articles/10.3389/fmed.2022.810761/full
[2] Welsh J A, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles, 2024.
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