Cas9 / Cas12 / Cas13 / Cas14 到底差在哪？ 一次讲清四大 CRISPR 效应蛋白

CRISPR 工具箱里的"Cas"后面跟的数字，不只是编号，而是分属不同进化分支的三类效应蛋白。搞清楚差异比背参数更有用——因为这些参数直接决定了你能切什么、在哪儿切、切完留下什么末端。

一、先立个坐标：它们不在同一类里

二类 CRISPR 系统（Class 2，靠单个效应蛋白干活）里，这几个成员分属三个 Type：

一句话概括分工：Cas9 和 Cas12 切 DNA，Cas13 切 RNA，Cas14 切单链 DNA。

二、逐个拆解

1. Cas9（Type II）——体系最成熟的 DNA 双链剪刀

· 引导 RNA：天然状态下由 crRNA 与 tracrRNA 两条 RNA 共同引导，实验室里通常把两者融合成一条 sgRNA。

· 酶活结构域：HNH 与 RuvC，各切一条链——HNH 切与引导 RNA 配对的靶标链，RuvC 切另一条链。两条链在同一位置被切开，产物是平末端。

· 序列限制：需要 PAM。以最常用的 SpCas9 为例，PAM 为 5'-NGG-3'，位于靶序列 3' 端下游；切割发生在 PAM 上游约 3 bp 处。

· 实际影响：切割位点紧贴 PAM，NHEJ 修复产生的 indel 容易破坏识别序列，因此同一个位点较难被反复切割。

· 典型用途：基因敲除、敲入，细胞株与抗体表达工程，以及碱基编辑、先导编辑等技术路线的基础平台。

2. Cas12a（Type V-A，旧称 Cpf1）——只带一条 crRNA 的切割者

· 引导 RNA：仅需 crRNA，不需要 tracrRNA，设计更简单。

· 酶活结构域：以 RuvC 催化为主，没有 HNH 结构域；切割靶标链还需要 Nuc 结构域参与。

· 序列限制：识别 T 富集 PAM，位于靶序列 5' 端上游。经典基序为 5'-TTTV-3'（V = A/C/G）。早期文献普遍写作 TTTN，后续研究显示 TTTT 的切割效率明显偏低，因此更准确的描述是 TTTV。

· 切割产物：错位切割，留下 5' 突出的黏性末端（约 4–5 nt）；切割位点离 PAM 较远（非靶链在 PAM 下游约 18 nt、靶链约 23 nt），靶点被修复后仍可能再次被识别。

· 两项附带能力：其一，自身具有 RNase 活性，可加工 pre-crRNA，方便一条转录本里塞进多条 crRNA 做多重编辑；其二，结合靶标后会非特异切割周围的单链 DNA（反式切割），这是 DETECTR 类核酸检测信号放大的基础。

· 适合场景：AT 富集、缺少 NGG 位点的基因组。

3. Cas12b（Type V-B，旧称 C2c1）——双 RNA 引导、末端更长

· 引导 RNA：需要 crRNA + tracrRNA 组合（可融合为 sgRNA），这点与 Cas9 类似，与 Cas12a 不同。

· 序列限制：识别 5' 上游的 T 富集 PAM。不同同源物有差异，例如 AacCas12b 为 5'-TTN-3'，来源于 Bacillus thermoamylovorans 的 BthCas12b 则识别 5'-ATTN-3'。

· 切割产物：同样是错位切割，产生 5' 突出的黏性末端，长度约 6–8 nt，是目前报道中较长的一类。

· 温度特性：早期常用的 AacCas12b 来自嗜热菌，需要在较高温度（约 40 ℃ 以上）才有较好活性；后续从 Bacillus hisashii 等来源获得并经工程改造的版本（如 BhCas12b v4）可在 37 ℃ 下工作，才适用于哺乳动物细胞。

· 特异性：对靶序列错配较为敏感，有报道显示靶序列前段单个碱基错配即可阻断切割，被认为脱靶风险相对较低。

· 适合场景：高温培养体系，以及对特异性要求高的编辑任务。

4. Cas13（Type VI）——只对 RNA 出手的 RNase

· 靶标：单链 RNA。它没有切割 DNA 的催化能力，所以不用于常规基因组编辑。

· 酶活结构域：两个 HEPN 结构域（含 RxxxxH 特征基序），二者组成复合活性中心。

· 引导 RNA：crRNA，不需要 tracrRNA。

· 序列限制：不是 PAM，而是 PFS（protospacer flanking site）。不同亚型要求不同——例如 LshCas13a 需要靶标 3' 端为非 G，Cas13b 在靶序列两侧都存在偏好；也有亚型的限制相当宽松。

· 两种切割活性：识别靶标 RNA 后先切靶标（顺式），随后被激活，非特异切割周围的单链 RNA（反式切割 / 旁切）。

· 需要纠正的一点：反式切割活性 Cas13a 与 Cas13b 都具备，并不是"只有 Cas13a 才有范围伤害"。区别更多来自工程改造与亚型选择——例如 PspCas13b 经改造后旁切活性较低，常被用于 RNA 编辑（失活版本融合 ADAR2 脱氨酶实现 A-to-I 编辑）；而旁切活性恰恰是 SHERLOCK 类核酸检测放大信号的原理。

· 典型用途：转录本敲低、RNA 病毒抑制、非编码 RNA 与 RNA 修饰研究、RNA 编辑、核酸检测。

5. Cas14（Type V-F，现已统一命名为 Cas12f）——迷你 ssDNA 剪刀

· 发现来源：2018 年 Doudna 团队从未培养古菌的宏基因组数据中鉴定，属于 DPANN 类群。

· 尺寸：编码 400–700 个氨基酸（约 40–70 kDa），约为常规 Class 2 效应蛋白的一半，是体积最小的一类 CRISPR 效应蛋白之一。

· 家族规模：最初鉴定的 24 个基因变体，按序列分为 Cas14a / b / c 三个亚组；这些变体都带有 RuvC 核酸酶结构域。

· 序列限制：不依赖 PAM，这是它区别于 Cas9、Cas12a / b 的关键特征。

· 引导 RNA：由 tracrRNA:crRNA 引导，可设计为融合的 sgRNA。

· 切割特点：靶向单链 DNA；识别靶标后还会非特异反式切割 ssDNA。有研究指出，它在 ssDNA 识别上的特异性高于 Cas13、Cas12 对其底物的反式切割，因此适合做高保真 SNP 分型（Cas14-DETECTR）。

· 命名变更：2020 年 Koonin 团队将 Cas14 与其它 V-F 型效应蛋白统一归入 Cas12f。查文献时两套名字都要搜。

· 适用范围：最初报道的 Cas14 只切 ssDNA，并不适合常规双链 DNA 基因组编辑；后续鉴定与工程化的 Cas12f 成员（如 AsCas12f1）已能实现双链 DNA 编辑，因其体积小，在 AAV 递送等空间受限的场景受到关注。

三、核心参数对照表

表 1　身份与靶标

表 2　识别限制与产物

四、按需求反查：怎么选

· 就是要敲掉一个基因：优先 Cas9，体系最成熟、试剂与方案最多。

· 目标区域没有 NGG：换成 Cas12a，找 TTTV；或在 PAM 兼容性更广的 Cas9 变体里挑选。

· 基因组 AT 含量高：Cas12a 的 T 富集 PAM 通常比 Cas9 更好用。

· 需要黏性末端、或想一次改多个位点：Cas12a（crRNA 短、可自加工，装载和多重都更方便）。

· 实验体系本身就是高温（如部分植物）：可以考虑 Cas12b。

· 只想动 RNA，不改基因组：Cas13；做 RNA 单碱基编辑用失活的 Cas13 融合脱氨酶。

· 要做 ssDNA 检测或 SNP 分型：Cas14（Cas12f）。

· 载体容量吃紧（如 AAV）：优先考虑小尺寸效应蛋白，Cas12f 是其中的代表。

五、几个容易写错的点

1. Cas12a 的 PAM 是 TTTV，不是笼统的 TTTN。早期文献写 TTTN，后续研究表明 TTTT 效率低。

2. PAM 有方向：Cas9 的 PAM 在靶序列 3' 端下游，Cas12a / b 的 PAM 在 5' 端上游。设计引导 RNA 前先确认方向。

3. Cas12a 不是"只有 RuvC"：切靶标链还需要 Nuc 结构域参与，只是 RuvC 是主要催化中心。

4. 不要认为 Cas13b 没有反式切割：Cas13a 与 Cas13b 都具备，"更精确"通常指的是被工程化改造过的特定亚型（如 PspCas13b）。

5. Cas14 已经改名：现统一归入 Cas12f 家族，检索时要搜两个名字。

6. 黏性末端长度不一样：Cas12a 约 4–5 nt，Cas12b 约 6–8 nt，做定向克隆时会影响接头设计。

7. Cas13 的限制不是 PAM，是 PFS，而且不同亚型差异很大。

结语

这四个成员的关系不是"新旧替代"，而是靶标与场景的分工：Cas9 解决"切得准"，Cas12a 解决"切得巧"（位点更多、末端可用、能多重），Cas12b 补上高温与高特异的场景，Cas13 把工具伸向 RNA 层面，Cas14 / Cas12f 则用极小体积切进 ssDNA 和检测领域。

选型的起点永远是两个问题：我要切的核酸是什么类型？目标序列旁有什么可用的识别基序？

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