HUVEC 细胞培养保姆级 SOP 及注意事项

HUVEC 为人脐静脉内皮细胞，是血管内皮损伤、氧化应激及心血管相关研究常用贴壁细胞。细胞严格贴壁、鹅卵石铺路石样形态，正常为多边形、梭形内皮样，排列规整，该细胞对血清、培养基敏感，对传代密度极敏感，易老化、易间质化，状态极易受环境、操作、血清质量影响，本文将针对HUVEC的细胞培养流程进行梳理和指导。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至 37℃；准备 9ml 培养基在37℃条件下预热；生物安全柜提前使用紫外照射 30min；

2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约 1‑2min；

3. 【重悬】使用75% 酒精擦拭冻存管外壁，生物安全柜内开盖，将细胞悬液缓慢滴入装有 9ml 预热完全培养基的 15mL 离心管中；

4.【离心】600rpm 离心 5min，弃上清；

5.【重悬】加入1ml完全培养基轻轻吹打10次细胞悬液。准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9ml完全培养基，再加入1ml细胞悬液。画十字混匀，使细胞在皿中均匀分布；

6.【培养】放入培养箱中培养。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制完全培养基：内皮细胞培养基（https://www.absin.cn/endothelial‑cell‑culture‑medium/abs9873.html，套装包括内皮细胞基础培养基，胎牛血清，内皮细胞添加剂）+1%P/S（abs9244‑100ml）。提前取出 PBS（https://www.univ‑bio.com/product/goods‑162652676‑abs962‑500ml‑PBS%E7%BC%93%E5%86%B2%E6%B6%B2%EF%BC%881%C3%97%EF%BC%89.html?skuId=6011256）、培养基、0.25% EDTA ‑ 胰酶（abs47047375‑100mL），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射 30min。

2.【镜检】在显微镜下观察细胞，细胞密度约 80%，且细胞形态规整呈铺路石状态即可进行传代；

3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿着培养皿壁缓慢加入 2ml PBS，轻轻摇晃培养皿让 PBS 均匀覆盖，吸弃 PBS；
注意：如果镜检下漂浮死细胞较多，可以再用 PBS 清洗一遍。

4.【细胞消化】加入 1ml 胰酶，轻轻晃动培养皿使得胰酶均匀分布，放至 37℃培养箱中进行消化 1‑2min；

5.【细胞收集】显微镜下观察到细胞变圆、回缩、间隙变大，立即加入 2ml 含血清的完全培养基终止消化。轻轻吹打皿底的细胞，使细胞脱落，并收集细胞至 15ml 离心管中；

6.【离心】600rpm 离心 5min 后，用枪头吸弃上清；加入 2ml 完全培养基，轻轻吹打 10‑15 次重悬细胞；
注意：该细胞传代比例 1:2，最多不超过1:3，可根据传代比例加入适量完全培养基。

7.【传代】准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9ml完全培养基，再加入1ml细胞悬液。画十字混匀，使细胞在皿中均匀分布；

8.【镜检】在显微镜下观察细胞状态及细胞是否均匀分布，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔24H观察细胞状态；
注意：该细胞传代密度一般为1:2，最多不超过1:3。低密度会导致细胞贴壁差、增殖停滞、快速老化。

三、细胞冻存

1.【准备工作】细胞冻存液可使用无血清细胞冻存液（abs9417‑100mL），也可以自行配制：90%FBS（abs972‑500mL）+10%DMSO（abs9187‑100mL）。存管提前标注：细胞名称、代数、冻存人、冻存日期。生物安全柜提前使用紫外照射30min；
注意：该细胞对冻存密度敏感，建议单个皿冻存2只。

2.【细胞收集】细胞密度长到80%左右，按照传代步骤进行细胞收集，600rpm离心之后弃上清；

3.【细胞重悬】加入2ml细胞冻存液，轻轻吹打重悬细胞；

4.【冻存】每管加入1ml混合液至冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，放入‑80℃冰箱，过夜后转移至液氮罐中。

四、关键注意事项

1、严格控制传代密度
该细胞传代密度一般为1:2，最多不超过1:3。低密度会导致细胞贴壁差、增殖停滞、快速老化。

2、血清及培养基选择
（1）该细胞需使用优级或特级血清培养；
（2）该细胞需使用商业化内皮细胞培养基培养，内含专用的内皮细胞添加剂，普通DMEM+血清会导致细胞增殖缓慢状态差。

3、污染控制
易支原体感染，表现为长势慢、形态变差、莫名漂浮；定期支原体检测，操作全程无菌。

4、代数限制
HUVEC 属于有限细胞系，建议 10 代以内使用，高代数自发老化、形态畸变、功能丧失，不用于实验。

五、absin胎牛血清

产品优势

• 1. 优宁维旗下血清品牌；

• 2. 文献支持近300篇，最高IF=32.4；

• 3. 院士课题组稳定使用；

• 4. 近20种细胞验证数据，性能对标进口大牌；

• 5. 内毒素低 ＜3 EU/mL，血红蛋白低 ＜50 mg/L；

• 6. 单批次产能充足，批间差异小；

• 7. 专业技术支持，细胞培养专业SOP指导；

• 8. 50mL小包装分装服务；

• 9. 血清类型丰富，高效助力实验；

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