新维创科普┃多色实验串色严重？VB6-CY3在橙红通道的选择逻辑

多通道成像中的光谱串扰烦恼

做多色荧光成像的研究者，或多或少都被光谱串色问题困扰过。FITC的荧光发射尾巴会拖到CY3通道，DAPI在某些条件下也会漏到FITC通道，结果就是每张图都要做复杂的光谱拆分，拆完之后信号还可能失真。当实验需要同时标记三个靶标时，蓝、绿、红三个通道的信号串扰更让人头疼。在这种情况下，选择光谱分离度更好的染料组合就显得很重要。CY3的发射峰在570nm左右，介于FITC（519nm）和CY5（670nm）之间，光谱重叠相对可控，作为中间通道的标记物是一个可以考虑的选择。

为什么选CY3标记维生素B6

维生素B6是水溶性较强的小分子，选择CY3而非疏水性更强的罗丹明衍生物进行标记，一方面是因为CY3的水溶性相对较好，标记后整个偶联物在水相缓冲液中更容易分散；另一方面，CY3的荧光量子产率在生理pH范围内比较稳定，不像FITC那样对pH变化高度敏感，在pH6-8的常规缓冲液条件下信号波动较小。

VB6-CY3作为橙红通道的标记物，可以与DAPI（核标记）、FITC（另一靶标）配合使用，三个通道的信号分离度相对较好，后期图像处理时不需要过度校正串色。

CY3也有容易忽视的细节

不过CY3有个特点，很多人可能没注意到：它在结合某些蛋白或者进入疏水环境后，荧光强度会有明显增强。

这本来是个好事（信号更亮），但如果你在做定量实验——比如通过荧光强度计算VB6的浓度——这种环境敏感型增强就可能带来定量偏差。

同一个浓度的VB6-CY3，在水溶液中测到的荧光值和在蛋白溶液中测到的可能差不少，如果标准曲线是在纯水中做的，测蛋白样品时读数就会偏高。解决方法是做标准曲线时使用与样品相同的基质背景，尽量保证溶剂环境一致。

减少漂白与非特异性的小技巧

在共聚焦成像中，CY3通道的激发光功率建议先从低功率开始调试，不要一开始就用高功率，高功率不仅加速漂白，还可能增加光损伤。

如果样品需要在4℃保存一段时间再观察，固定后的样品建议用抗淬灭封片剂封片，未固定的活细胞样品则尽量在30分钟内完成成像。

非特异性吸附方面，CY3带正电，在带负电的玻璃表面或某些多聚物材料上可能吸附较强，实验前用BSA或血清封闭一下可以改善背景。

本文围绕荧光染料选择与多色成像实验设计展开技术讨论，供生命科学与材料科学领域研究者参考，产品禁止用于任何人体试验。

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