Raji细胞培养保姆级 SOP 及注意事项

Raji是人Burkitt's淋巴瘤细胞，是 CAR-T、NK 细胞杀伤、B 细胞受体信号、补体依赖细胞毒及免疫炎症通路研究的经典悬浮工具细胞。细胞天然聚团、对血清、细胞密度和机械吹打均高度敏感，状态极易受环境、操作、血清质量影响，本文将针对Raji的细胞培养流程进行梳理和指导。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至 37℃；准备 9ml 培养基在37℃条件下预热；生物安全柜提前使用紫外照射 30min；
2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约 1-2min；
3. 【重悬】使用75% 酒精擦拭冻存管外壁，生物安全柜内开盖，将细胞悬液缓慢滴入装有 9ml 预热完全培养基的 15mL 离心管中；
4.【离心】600rpm 离心 5min，弃上清；
5.【重悬】加入1ml完全培养基轻轻吹打10次细胞悬液。准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9ml完全培养基，再加入1ml细胞悬液。画十字混匀，使细胞在皿中均匀分布；
6.【培养】放入培养箱中培养。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制完全培养基：1640 基础培养基（abs9484） + 10% FBS（abs972）+1% 双抗 (P/S)（abs9244）；提前取出PBS（abs962）、完全培养基，恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。
2.【镜检】在显微镜下观察细胞，细胞密度约80%、轻轻晃动培养皿有大量悬浮的细胞，培养基颜色轻微变黄时即可进行传代；
3.【细胞收集】将所有细胞悬液收集至 15mL 离心管中；
4.【离心】600rpm 离心 5min后，用枪头吸弃上清；加入 3ml 完全培养基，轻柔吹打 10 次左右重悬细胞；
注意：如果细胞状态较差或者细胞碎片较多，在这一步弃去上清后，加入10mlPBS吹打重悬，600rpm离心去上清后再进行传代。
注意：该细胞对操作较为敏感，吹打时务必不要大力吹打，容易造成细胞损伤。
注意：该细胞传代比例建议为1:3-1:4，可根据传代比例加入适量完全培养基。
5.【传代】准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9ml完全培养基，再加入1ml细胞悬液。画十字混匀，使细胞在皿中均匀分布；
6.【镜检】在显微镜下观察细胞状态及细胞是否均匀分布，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔24H观察细胞状态；
注意：该细胞对血清敏感，建议使用爱必信优级血清，劣质血清会导致细胞生长速度慢。
注意：一般3×10⁵~2×10⁶ cells/mL 的密度最为适宜。过稀会停止增殖甚至死亡，过密会很快凋亡。

三、细胞冻存

1.【【准备工作】细胞冻存液可使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL），也可以自行配制：90%FBS（abs972-500mL）+10%DMSO（abs9187-100mL）。存管提前标注：细胞名称、代数、冻存人、冻存日期。生物安全柜提前使用紫外照射30min；
注意：该细胞对冻存密度敏感，建议单个皿冻存3只。
2.【细胞收集】细胞密度长到80%左右，按照传代步骤进行细胞收集，600rpm离心之后弃上清；
3.【细胞重悬】加入3ml细胞冻存液，轻轻吹打重悬细胞；
4.【冻存】每管加入1ml混合液至冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃冰箱，过夜后转移至液氮罐中。

四、关键注意事项

• 严格控制传代密度：一般3×10⁵~2×10⁶ cells/mL 的密度最为适宜。过稀会停止增殖甚至死亡，过密会很快凋亡。

• 血清选择：该细胞对血清敏感，需使用优级血清，劣质血清会导致细胞生长速度慢。

• 污染控制：易支原体感染，表现为长势慢、形态变差；定期支原体检测，操作全程无菌。悬浮细胞是支原体污染的重灾区。若细胞莫名生长迟缓、碎片增多，第一时间检测支原体。

• 操作：Raji 是 EBV 阳性的人 Burkitt 淋巴瘤 B 细胞，需在二级生物安全柜操作。传代时不与其他细胞一起，避免污染其他细胞。

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