克隆形成实验全流程攻略

发布人：上海信裕生物科技有限公司

发布日期:2026/8/26 16:37:33

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克隆形成实验全流程攻略！

做细胞功能实验的小伙伴一定都知道：CCK-8看短期活力，克隆形成看长期增殖与成瘤潜能。

很多同学做完MTT、CCK-8实验，数据很漂亮，一做克隆形成直接翻车：克隆大小不均、染斑模糊、复孔差异大、实验组和对照组无差异。

究其根本，是没吃透克隆形成实验的核心逻辑。

今天这篇推文，一次性带大家彻底搞懂克隆形成实验（平板集落形成实验），从实验原理、适用场景、详细操作步骤、结果计算，到高频踩坑要点，新手也能直接照着做、直接出合格数据。

一

什么是克隆形成实验？核心原理

克隆形成实验是细胞生物学、肿瘤学、药物筛选领域的经典金标准实验，主要用于评估单个细胞的长期存活、克隆增殖能力和成瘤潜能。

简单来说：能单个存活、持续分裂、长成细胞集落的细胞，才具备干性和成瘤能力。

实验核心原理：

将细胞制备成均匀的单细胞悬液，低密度接种培养，让单个细胞独立增殖，经过5–6代以上分裂，形成含有≥50个细胞的肉眼可见细胞集落（克隆），通过统计克隆数量、大小，量化细胞增殖、存活能力。

⚠️ 行业通用判定标准：单个集落细胞数≥50个，才算有效克隆，这也是国际通用的实验判定标准。

二

什么时候需要做克隆形成实验？

很多人分不清CCK-8和克隆形成的区别，这里给大家明确区分：

✅ CCK-8/MTT：短期（24–72h）细胞活力、增殖速率、药物急性毒性

✅ 克隆形成实验：长期、单克隆水平的增殖潜能、干性、成瘤能力、药物长效抑制效果

常见适用场景：

验证基因过表达/敲低对肿瘤细胞增殖能力的影响
筛选抗肿瘤药物，评估药物长期抑制效果
检测细胞放疗、化疗后的存活与修复能力
评估肿瘤细胞干性、侵袭转移潜能
对比不同细胞株的成瘤能力差异

三

完整实验操作流程（新手直接照搬）

第一步：细胞准备与单细胞悬液制备

1. 取对数生长期、状态良好的细胞，弃旧培养基，PBS轻柔清洗1–2次，去除残留血清与死细胞。

2. 加入适量胰酶消化，显微镜下观察细胞变圆、轻微脱壁后，立即加入完全培养基终止消化。

3. 轻柔吹打细胞，充分吹打成单细胞悬液，无细胞团块（团块会导致多细胞起始，数据严重偏差）。

4. 细胞计数，根据细胞增殖速度调整接种数量。

接种量参考（6孔板通用）：

增殖快细胞（293T）：500–800个/孔

中等增殖细胞（A549）：800–1000个/孔

增殖慢细胞（MCF-7）：1000–1500个/孔

第二步：低密度接种、恒温培养

1. 按预设密度接种至6孔板，轻轻十字摇匀，避免细胞聚集在孔板边缘。

2. 放入37℃、5% CO₂恒温培养箱静置培养，严禁频繁晃动、挪动孔板，防止细胞移位、克隆分散。

3. 培养周期根据细胞类型调整：7–14天不等，期间每2–3天显微镜观察一次，按需换液。

培养周期参考：

293T：约7天；A549：10–12天；MCF-7：约14天

第三步：终止培养（关键判定点）

当显微镜下大部分集落细胞数≥50个、肉眼可见清晰白色小点时，立即终止培养，避免克隆过大、融合重叠，无法计数

第四步：固定与结晶紫染色

1. 轻柔弃去孔内培养基，沿孔壁缓慢加入PBS清洗1次，切勿直接冲刷孔底，避免冲散克隆。

2. 加入4%多聚甲醛固定液，室温固定15–20分钟。

3. 弃固定液，蒸馏水轻柔清洗，自然晾干。

4. 加入0.1%结晶紫染色液，室温染色10–15分钟。

5. 缓慢流水冲洗多余染液，直至背景干净，室温彻底晾干。

第五步：拍照、计数与数据分析

1. 扫描仪或显微镜明场拍照留存图片；

2. 统计每孔≥50个细胞的有效克隆数；

3. 计算克隆形成率，每组设置3个复孔取平均值，减少实验误差。

四

核心计算公式（论文通用）

克隆形成率（%）=（平均克隆数 / 接种细胞总数）× 100%

相对克隆形成率（药物/处理组对比对照组）：

相对克隆形成率（%）=（处理组克隆形成率 / 对照组克隆形成率）× 100%

💡 数据解读：

克隆数量多、体积大：细胞增殖能力、干性、成瘤能力更强
克隆数量少、体积小：基因抑制、药物起效、细胞增殖能力受损

五

高频踩坑汇总（90%新手都错在这里）

1.细胞未吹打成单细胞

存在细胞团块，会导致多个细胞起始形成克隆，克隆数量虚高，数据完全无效，是最常见的实验失败原因。

2.接种密度过高

细胞密度太大，克隆快速生长、互相融合，无法区分单个集落，最终无法计数。

3.培养期间频繁移动、晃动孔板

细胞移位、克隆分散、形态不规则，复孔差异极大，数据重复性差。

4.染色冲洗力度过大

直接冲刷孔底，会冲掉细小克隆，导致计数偏少，结果失真。

5.培养时间过长或过短

时间过短：克隆细胞数不足50个，不属于有效克隆；时间过长：克隆融合、脱落，无法统计。

6.细胞状态差、存在支原体污染

老化、污染的细胞增殖异常，克隆大小不均、数量紊乱，实验数据无参考价值。

六

实验总结与发文小贴士

如果说CCK-8看的是细胞短期活力，那克隆形成实验看的就是细胞长期增殖潜能与干性。

在肿瘤机制、药物研发、基因功能验证类论文中，克隆形成实验的数据说服力远高于普通增殖实验，是高分文章的标配实验。

只要把控好单细胞悬液、合适接种密度、精准培养周期、轻柔染色冲洗这四个核心要点，就能轻松做出整齐、好看、可重复的实验结果。

END