保姆级人ALI皮肤模型分化攻略

今天给大家介绍一种采用气液界面(Air-Liquid Interface, ALI)法培养的三维人全层皮肤(真皮+表皮)模型，包括原代细胞提取与培养、正常重组皮肤构建两大阶段。

主要用到的试剂盒

人ALI皮肤模型分化试剂盒组成(abs90781)

注：如果不立即使用，请将以上组分按需分装并储存在-20℃下。请不要反复冻融。

1 原代细胞提取与培养

原代角质细胞与原代成纤维细胞提取与培养操作流程示意图

1.1 皮肤组织处理

a)实验材料准备：

• PBS(abs9459)；

• Hanks平衡盐溶液(含Ca²⁺、Mg²⁺，含酚红)(abs9436)；

• 分散酶Ⅱ(5mg/mL)(abs47038999，用Hanks(abs9436)溶解Dispase II冻干粉，配制成5mg/ml，用0.22µM滤膜过滤除菌)；

• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；

• 胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025%)(abs47014938，0.25%，需要用PBS稀释10倍)；

b)在10 mm小皿中倒入5 mL左右PBS，然后将样本从样本管倒入小皿中，用PBS反复吹洗样本2-3次，用力吹洗样本的正反面。

c)样本在75%酒精中涮洗1 s，然后迅速把样本转移至PBS中。

d)通过使用镊子搅拌10 mm 培养皿中的PBS来洗涤组织。

e)使用无菌镊子，将组织铺展平放于10 mm培养皿的翻转盖上，表皮侧朝下。

f)使用镊子剪掉所有脂肪和松弛的筋膜。为防止组织变干，请每隔几分钟用放入10 mm培养皿内的PBS冲洗一次。

g)修剪完成后，使用无菌手术刀将组织切割成0.5 cm³大小的组织块。

h)向15 mL无菌锥形离心管中加入5mL–8mL分散酶溶液。

i)将切割的组织转移到含有5mL—8mL分散酶溶液的试管中。确保组织块浸没在溶液中。盖紧试管。将试管转移到4 ℃冷藏冰箱中。在4 ℃下孵育16 h – 18 h小时。

j)分散酶酶解后，取回含有组织的试管，取出一个10 mm无菌培养皿，将酶解的组织和附带的分散酶溶液转移到10 mm培养皿底部，避免飞溅。如有任何组织块留在瓶中，请使用1 mL无菌移液器或无菌镊子将组织块转移到10 mm培养皿底部。将表皮与真皮分开。

k)一次处理一块组织，将组织块转移到培养皿的翻转盖上。调整组织块的方向，使表皮朝上。用一把无菌镊子固定组织块的一端，用另一把无菌镊子夹住表皮边缘。撕开/剥离真皮与表皮，使其分开位于同一盖子上。快速操作，为每个组织块重复该过程。

1.2 原代角质形成细胞提取与培养

(1)原代角质细胞提取

a)实验材料准备：

• 人原代角质细胞培养基(abs90781里组分)；

• 胰蛋白酶⁄EDTA溶液(0.025%)(abs47014938，0.25%，需要用PBS稀释10倍)；

• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；

• PBS(abs9459)；

• Ⅰ型胶原(50μg/mL)(abs47014921，5 mg/mL，需要用6mM HAc 溶液稀释成50μg/mL；6mM HAc 溶液配制方法：取34.5μL 冰醋酸(17.4 M)加入100ml 双蒸水，充分混匀后用0.22μm 滤膜过滤除菌后待用)；

• 预包被Ⅰ型胶原的T25培养瓶(abs7011，向瓶中加入2 mL稀释后的Ⅰ型胶原(50μg/mL)，室温静置1 h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS 清洗3~4 次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3 个月。)。

b)将表皮收集转入装有10 mL PBS的15 mL离心管中，1500 rpm，室温离心5 min；弃上清。

c)在60 mm小皿中倒入1 mL左右PBS，然后将样本从样本管倒入小皿中。

d)用手术刀将样本切为糊状，收集转入15 mL离心管，1500rpm，室温离心5min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，再加入5 mLPBS，反复吹洗，再次离心，1500rpm，室温离心5min。

e)弃上清，将5 mL - 8 mL 0.025%的胰蛋白酶⁄EDTA溶液添加到15 mL锥形管中，摇床220rmp，振荡15 min – 25 min。

f)向细胞悬液中加入5 mL – 8 mL完全培养基来中和胰蛋白酶⁄EDTA溶液，反复吹打以释放表皮细胞。

g)100 μm滤网过筛，用枪头研磨组织，使组织尽量完全过了筛网。1500 rpm，室温离心5 min，弃上清，不要移动细胞沉淀。

h)吸取1mL 原代角质形成培养基重悬细胞沉淀，反复吹打以确保细胞悬液均匀。取20 uL细胞悬液与20 uL的台盼蓝1:1混匀计数。

i)准备预先铺好Ⅰ型胶原的T25板，加入2 mL PBS清洗，弃掉PBS。

j)在一个瓶中加入细胞量为1.0×10⁶ - 2.5×10⁶的细胞悬液，添加培养基补至总体积为3 mL，放入培养箱培养。

k)原代角质形成细胞初始接种完成，观察到发生贴壁生长后，更换培养基，此后至少每48 h更换一次。

l)一旦细胞汇合80%，进行细胞进行传代培养或冻存。

(2)原代角质细胞传代

a)从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被。

b)立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 0.025%的胰蛋白酶⁄EDTA溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育5 min – 10 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离。

c)从培养瓶中释放细胞后，将2 mL 完全培养基添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞。

d)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1 mL角质形成细胞培养基重悬，使用计数仪测定悬液中的细胞浓度。

e)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入3 mL角质形成细胞培养基重悬；

f)将细胞稀释于补充培养基中，并以细胞总量为5×10⁵ - 1×10⁶的密度接种于预包被并清洗后的T25培养瓶中，加入培养基补齐至3 mL，于培养箱中培养。此后至少每48 h更换一次。

(3)原代角质形成细胞冻存

a)消化步骤同原代角质细胞传代操作步骤。

b)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1mL冻存液(FBS+10%DMSO)，重悬，转至2 mL冻存管中。冻存管放入程序降温盒中，放置于-80℃冰箱，次日转入液氮。

1.3 原代成纤维细胞提取与培养

(1)原代成纤维提取

a)实验材料准备：

• 人原代成纤维细胞培养基(abs90781里组分)；

• 重组胰酶细胞消化液(abs9411)；

• 胶原酶Ⅳ溶液(10 mg/mL)(abs47048003，用Hanks(abs9436)溶解DMEM(abs9483)溶解胶原酶Ⅳ冻干粉，配制成10mg/ml，用0.22µM滤膜过滤除菌)；

• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；

• PBS(abs9459)；

• Ⅰ型胶原(50μg/mL)(abs47014921，5 mg/mL，需要用6mM HAc 溶液稀释成50μg/mL；6mM HAc 溶液配制方法：取34.5μL 冰醋酸(17.4 M)加入100ml 双蒸水，充分混匀后用0.22μm 滤膜过滤除菌后待用)；

• 预包被Ⅰ型胶原的T25培养瓶(abs7011，向瓶中加入2 mL稀释后的Ⅰ型胶原(50μg/mL)，室温静置1 h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS 清洗3~4 次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3 个月。)。

b)将真皮收集转入装有10 mL PBS的15 mL离心管中，1500rpm，室温离心5 min；弃上清。

c)在60 mm小皿中倒入1 mL左右PBS，然后将样本从样本管倒入小皿中。

d)用眼科剪将样本切为糊状，收集转入15 mL离心管，1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，再加入5mL组织清洗液，反复吹洗，再次离心，1500 rpm，室温离心5 min。

e)弃上清，将5 mL - 8 mL 10 mg/mL 胶原酶Ⅳ溶液添加到15 mL锥形管中，摇床220 rmp，振荡70 min - 80 min。

f)向细胞悬液中加入5 mL – 8 mL 完全培养基来终止胶原酶Ⅳ溶液，反复吹打以释放成纤维细胞。

g)100 μm滤网过筛，用枪头研磨组织，使组织尽量完全过了筛网。1500 rpm，室温离心5 min，弃上清，不要移动细胞沉淀。

h)添加3 mL红细胞裂解液，4 ℃放置3 min，1500 rpm离心5 min，弃上清；若红细胞未裂解完全则重复裂解操作一次。

i)吸取1 mL 原代成纤维培养基重悬细胞沉淀，反复吹打以确保细胞悬液均匀。取20 uL细胞悬液与20 uL的台盼蓝1:1混匀计数。

j)准备预先铺好Ⅰ型胶原的T25板，加入2 mLPBS清洗，弃掉PBS。

k)在一个瓶中加入细胞量为5×10⁵ - 2×10⁶的细胞悬液，添加培养基补至总体积为3 mL，放入培养箱培养。

l)原代成纤维细胞初始接种完成，观察到发生贴壁生长后，更换培养基，此后至少每48 h更换一次。

m)一旦细胞汇合80%，进行细胞进行传代培养或冻存。

(2)原代成纤维细胞传代

a)从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被。

b)立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 类器官解离试剂溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育3 min – 5 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离。

c)从培养瓶中释放细胞后，将2 mL完全培养基溶液添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞。

d)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1 mL成纤维细胞培养基重悬，使用计数仪测定悬液中的细胞浓度。

e)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入3 mL成纤维细胞培养基重悬；

f)将细胞稀释于补充培养基中，并以细胞总量为5×10⁵ - 1×10⁶的密度接种于预包被并清洗后的T25培养瓶中，加入培养基补齐至3 mL，于培养箱中培养。此后至少每48 h更换一次。

(3)原代成纤维细胞冻存

a)消化步骤同原代成纤维细胞传代操作步骤；

b)将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，将上清尽量完全弃干净，加入1 mL冻存液(FBS+10%DMSO)，重悬，转至2 mL冻存管中。冻存管放入程序降温盒中，放置于-80 ℃冰箱，次日转入液氮。

2 正常重组皮肤构建

皮肤模型构建操作流程示意图

2.1 实验前准备：

2.2 真皮层构建(以Transwell小室24孔板为例)：

1、实验材料准备：

• ALI成纤维培养基；

• 重组胰酶细胞消化液(abs9411)；

• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))；

• PBS(abs9459)；

• PBS(10X)(abs961)；

• NaOH(0.1M)；

• Ⅰ型胶原(4.38 mg/mL)(abs47014921，5mg/mL，需要用6mM HAc 溶液稀释成4.38 mg/mL；6mM HAc 溶液配制方法：取34.5μL 冰醋酸(17.4 M)加入100ml 双蒸水，充分混匀后用0.22μm 滤膜过滤除菌后待用)；

• 细胞小室(PET膜，6.5mm，孔径0.4um，含24孔板)(abs7280)

2、从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被；

3、立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 重组胰酶细胞消化液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育3 min – 5 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离；

4、从培养瓶中释放细胞后，将2 mL DMEM完全培养基溶液添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞；

5、将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，备用；

6、在冰上将Ⅰ型胶原用1M NaOH调节PH为中性，比例约为Ⅰ型胶原：PBS：0.1M NaOH=1 mL：120 μL：200 μL，充分混匀；

7、向细胞沉淀中加入调节为中性的Ⅰ型胶原，并以5×10⁶cells/mL的密度将细胞以每孔120 μL接种于24孔Transwell小室中，均匀铺满小室底面，转移至培养箱中37 ℃放置一个小时，待胶原凝固；

8、胶原凝固后，在小室内加入100μL ALI成纤维培养基，小室外加入200 μL ALI成纤维培养基，转移至培养箱培养；

9、每天更换小室内外的ALI成纤维培养基，培养4天后可在镜下观察到成纤维细胞生长，将其作为真皮层，此时可在真皮层上接种角质形成细胞。

2.3 表皮层构建( 以24孔板为例 )：

1、实验材料准备：

• 表皮分化A-D阶段培养基；

• PBS(abs9459)；

• 胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025%)(abs47014938，0.25%，需要用PBS稀释10倍)；

• DMEM完全培养基(DMEM(abs9483)+10%FBS(abs972))

2、从培养瓶中移除所有培养基。向培养瓶中加入2 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被；

3、立即从培养瓶中移除PBS溶液，并加入2 mL 10%的胰蛋白酶/EDTA溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀，室温下孵育5 min–10 min。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离；

4、从培养瓶中释放细胞后，将2 mL完全培养基添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞；

5、将细胞以1500 rpm，室温离心5 min；弃上清，备用；

6、以每孔5×10⁵的细胞量用100 μL 分化培养基A重悬接种入24孔Transwell小室中，待其形成表皮层；

7、分化阶段A：向小室外加入200 μL分化培养基A并每天换液，分化2天后，弃去小室内外的分化培养基A，完成分化阶段A的分化；

8、分化阶段B：向小室外加入200 μL分化培养基B并每天换液，培养2天后，弃去小室外的分化培养基B，完成分化阶段B的分化；

9、分化阶段C：向小室外加入200 μL分化培养基C并每天换液，培养2天后，弃去小室外的分化培养基C，完成分化阶段C的分化；

10、分化阶段D：向小室外加入200 μL分化培养基D并每天换液，培养3天后，完成表皮分化；取出小室，用手术刀取下其中一个小室中的PET膜及其黏附的全层皮肤组织，将组织浸入组织固定液中，送检测定HE。

备注：只有阶段A小室内外含培养基，阶段B、C、D小室内都不含培养基，只有小室外含培养基。

2.4 注意事项

1. 本产品在使用前需平衡至室温。

2. 使用产品时应注意无菌操作，避免污染。

3. 本品含抗生素，如无特殊需要，可直接使用，无需任何添加。

4. 为保持本产品的最佳使用效果，不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中。

5. 为达到预期效果，请于保质期内使用本产品。

6. 离心弃上清时，底部不要完全弃尽，防止损失样本量。

7. 本模型构建涉及多步消化过程，消化时间过长会影响细胞活性。

8. Ⅰ型胶原偏酸性，室温下不易凝固，需要调节PH为中性才易凝固。

9. Ⅰ型胶原浓度偏低，不易凝固，本实验采用4.38mg/mLⅠ型胶原，经多次试验测试能够凝固，若购买Ⅰ型胶原浓度过低，可用高浓度Ⅰ型胶原进行调节，凝固完全才能加入培养基

10. 在构建表皮时需在镜下确定真皮层的成纤维细胞状态良好。原代成纤维细胞由组织消化接种为P0代，进行重构皮肤构建时，需使用P5代以前的角质形成细胞。成纤维状态跟成纤维代次相关，代次越高，状态越差；且消化时间长短严重影响成纤维状态，消化过度，成纤维在Ⅰ型胶原内几乎不生长。

11. 原代角质细胞由组织消化接种为P0代，进行重构皮肤构建时，需使用P3代以前的角质形成细胞。

12. 在完成模型构建后，用手术刀小心取下模型，避免损伤质地柔软的模型组织。

13. 本产品仅用于科研用途，不能用于体外诊断。

2.5 模型鉴定

ALI培养人3D皮肤模型

• 使用爱必信的人ALI皮肤模型分化试剂盒可成功在Transwell小室中培养分化出全层皮肤(真皮+表皮)。

• 其中表皮可分化出清晰的四层结构(基底层、棘层、颗粒层、角质层)，与原始组织一致。

• 不同浓度SDS作用24h后，检测细胞活力，半数抑制浓度IC50≥1.0 mg/mL。表明自研构建的重组人类表皮模型具备完整的屏障功能，至少能有效抵抗0.1% SDS持续24小时的刺激。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

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关键词：皮肤模型、ALI皮肤模型、气液界面皮肤模型、人全层皮肤模型、真皮+表皮模型