流式细胞术鉴定小鼠小胶质细胞的具体步骤

流式细胞术鉴定小鼠小胶质细胞的完整操作方案，适配常规小鼠脑组织样本，可高效获得高纯度目标细胞群，排除外周免疫细胞干扰。

一、实验前准备

‌样本与试剂‌：准备目标小鼠脑组织样本，提前配置组织消化酶混合液、髓鞘去除液、流式染色缓冲液、Fc受体阻断剂，以及CD11b、CD45等核心荧光标记抗体。

‌仪器耗材‌：准备全自动组织处理器、4℃低温离心机、70 μm细胞筛网、光谱流式细胞仪，配套FlowJo分析软件。

二、单细胞悬液制备

冰上快速解剖分离目标脑区组织，放入提前预冷的组织处理管中，加入配置好的酶混合液。

将处理管放置在全自动组织处理器上，选择37℃适配的组织解离程序，完成酶解处理。

程序结束后300 g 4℃离心弃上清，用预冷D-PBS重悬细胞，经70 μm筛网过滤去除未消化的组织团块。

加入髓鞘去除试剂，通过密度梯度离心分层，吸除上层髓鞘和碎片层，收集下层细胞沉淀。

预冷D-PBS重悬细胞沉淀，1000 g 4℃离心10 min，弃上清完成单细胞悬液制备。

三、细胞染色操作

用1 mL染色缓冲液重悬细胞沉淀，取100 μL细胞悬液转移至新流式管中。

300 g 4℃离心弃上清，加入提前稀释好的Fc受体阻断剂，室温避光孵育5 min，阻断非特异性结合位点。

按照预实验优化好的抗体组合，加入CD11b、CD45等荧光标记抗体，4℃避光孵育15~30 min。

加入2 mL染色缓冲液洗涤细胞，300 g离心弃上清，重复洗涤1次，最终用适量染色缓冲液重悬细胞待上机。

四、上机检测与圈门分析

提前开启流式细胞仪进行光路校准，设置对应荧光通道的电压参数，使用荧光减一（FMO）对照完成补偿校准。

上机后先通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）圈出完整细胞群，排除碎片和粘连细胞。

基于CD11b+、CD45中等表达的特征圈门，即可精准鉴定出小鼠小胶质细胞，排除CD45高表达的外周浸润免疫细胞干扰。

导出数据后使用FlowJo软件进行后续亚群分析，可进一步区分稳态型、疾病相关型等不同功能表型的小胶质细胞。