TSA多重免疫荧光实验常见问题解答
1. 能否使用冰冻漂片进行TSA实验？
TSA试剂盒不适用于漂片。因为漂片厚度太厚，不利于试剂的渗透。漂片在染色过程中形态会发生改变，如卷曲，褶皱等。
2. 做石蜡切片mIHC，抗体应该怎样选择？
尽量选用单克隆抗体，抗体应用选用 IHC /mIHC/ IHC-P，优先选用经过敲除验证的抗体。
3. 为什么会产生非特异性结合？
①若使用多克隆抗体，容易产生非特异性结合，可以换用单克隆抗体或者降低浓度以及修复强度来改善。
②信号放大过强，可以降低染液反应时间或者浓度。
③一抗浓度过高或者抗原修复过度，采用比较低的稀释抗体比例，或降低抗原修复强度。
4. 切片出现脱片，如何避免？
①载玻片未做防脱处理，可以使用防脱载玻片或对载玻片进行防脱处理。
②组织固定不彻底或脱水不充分，重新优化样本前处理方式，如延长固定和脱水时间。
③过度热抗原修复处理，采用微波修复温和修复，修复温度控制在 80℃左右或更低，修复液可用2×柠檬酸（PH6.0）。
④洗脱液温度过高，降低洗脱液温度或缩短孵育时间。
5. 为什么会串色？
①可能与成像设备滤光片带宽有关系，尽量选用窄波长带宽的滤光片。
②可能与上一轮抗体未被完全洗脱有关系，对于一些亲和力比较高的抗体比如 CK 等，抗体洗脱条件需要延长（提高洗脱温度和时间等）。
③可能与信号不平衡有关系，比如相邻两个通道染料，一个强度过高，一个过低，导致强的信号发生外溢。
④其他可能存在的原因，比如抗体弄混，下一轮抗体忘记洗脱/修复等。
6. 样本为小鼠，是否可以选择小鼠来源的一抗？
通常不建议采取这种方式，因为如果一抗来源于小鼠，那么二抗也需使用抗小鼠的二抗，这可能会与样本中本身存在的IgG发生交叉反应，从而导致非特异性结合。
若必须使用与样本同种属来源的一抗，建议进行阴性对照实验，即在未添加一抗的情况下，仅加入二抗，以检测是否会产生非特异性信号。
7. 做多标时，指标/抗体顺序如何选择？
难以洗脱的抗体，摆在最后一轮，不然容易串色。兔鼠一抗交叉做。比较难做的指标放在前面几轮做。低表达靶标选择荧光强度高、抗淬灭性强的染料，并放在前几轮做。高表达靶标选择荧光强度适中的染料，避免信号饱和掩盖细节。若两种蛋白共表达，建议选择波长差异大的。
8. 传统荧光染色和TSA多重免疫荧光能否搭配使用？
可以，但建议将传统荧光染色安排在最后一轮进行。这是由于TSA法在抗体洗脱过程中，会同时洗脱一抗和二抗的结合物。
9. 骨组织染色背景过高的原因有哪些？
①固定不充分或过度固定。固定不足会导致抗原扩散，过度固定可能引起非特异性结合。解决：优化固定时间（通常4%多聚甲醛24小时内），避免使用酸性脱钙液破坏抗原。
②强酸脱钙液（如盐酸、硝酸）可能破坏抗原表位或增加非特异性结合。解决：改用EDTA脱钙液。
③抗体浓度过高导致背景过高。解决：降低抗体浓度。
④染料显色时间过长。解决：建议先显色5min为主，信号弱可延长显色时间。
10. 实验操作过程需要避光吗？染好的片子可以保存多久？
Enklife TSA试剂盒的荧光染料具有优异的抗淬灭性能，因此无需在日光灯下进行避光操作，使用过程中也无需在暗环境中进行。不过，请注意避免试剂盒暴露在太阳光下直射。且染色玻片在4℃条件下通常可保存6至12个月。
11. 关于细胞爬片做TSA多重免疫荧光的注意事项
①细胞爬片不用抗原修复。
②抗体洗脱可用抗体洗脱液温和洗脱
③抗体洗脱时间不宜过长，否则细胞核标记不上
④做细胞爬片选择适用于IF/ICC的抗体
12. 关于冰冻切片做TSA多重免疫荧光的注意事项
①建议尽量使用石蜡切片
②新鲜组织比固定组织贴片更牢固
③冰切掉片风险比较大，特别是15um以上的厚度
④抗体洗脱可用抗体洗脱液温和洗脱
⑤建议冰冻切片控制在三标以内
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