RNA干扰技术原理、机制及应用

RNA 干扰是由 RNA 分子介导的基因沉默调控机制。该机制通过 siRNA、miRNA 等非编码 RNA 与靶基因 mRNA 发生序列特异性结合，进而介导靶 mRNA 降解或抑制其翻译过程，最终实现靶向基因表达沉默与功能抑制。

RNA干扰技术通常涉及到以下几种RNA:

①miRNA(micro RNA)，小分子核糖核酸/微核糖核酸，真核中广泛存在的一类长约22nt(21-24nt)的有茎环结构的RNA分子，成熟miRNA为单链，可诱导标靶基因的mRNA降解或抑制其蛋白质翻译来调控目的基因的表达。

miRNA结构示意图

②siRNA(small interfering RNA)，小干扰核糖核酸，是一类长约19-25nt(实验中通常为19nt或21nt，干扰效率较高)的双链RNA分子，一般3'端有两个游离碱基，可使mRNA降解。

siRNA结构示意图

③shRNA(short hairpin RNA)，小/短发夹RNA，依赖茎环结构产生的短双链RNA，长约19-25nt，在细胞内经酶切产生siRNA。

shRNA结构示意图

最终发挥沉默效应的主要是siRNA和miRNA

siRNA和miRNA干扰机制

miRNA翻译抑制或基因沉默机制：

miRNA由内源性基因转录而来，其初级转录本(pri-miRNA)在细胞核中被Drosha和DGCR8处理形成前体miRNA(pre-miRNA)。随后被Exportin 5转运到细胞质后，pre-miRNA被Dicer酶进-步处理成为成熟miRNA。

成熟miRNA链与Ago1-Ago4蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)。

当 miRNA-RISC 复合物与靶 mRNA 的 3'UTR 发生不完全互补配对时，主要通过阻断核糖体结合、抑制翻译延伸等方式抑制蛋白质合成；若为完全互补配对，则可触发 Ago 蛋白的切割活性，导致靶 mRNA 降解，实现转录后基因沉默。

miRNA翻译抑制或基因沉默机制图

siRNA基因沉默机制：

合成的外源 siRNA 通过转染胞吞进入细胞，少量 siRNA 经溶酶体逃逸进入细胞质。siRNA 与 Dicer-TRBP 组成的 RISC 装载复合体结合，随后被转运至 Ago2 蛋白处，完成 RISC 复合物组装。组装后的 RISC 促使双链 siRNA 解旋，无功能的过客链随即降解，仅保留引导链。引导链与靶 mRNA 发生特异性互补结合，Ago2 利用内切酶活性切割靶 mRNA，断裂的核酸片段被胞内外切酶逐步降解，以此在转录后层面抑制基因表达，实现靶基因沉默效应。

siRNA基因沉默机制

shRNA、siRNA和miRNA干扰工具的对比

实验选择建议

RNA干扰技术的应用

l 基础医学与生命科学研究；

l 医药治疗领域；

l 农业领域：绿色防控与品质改良。