线粒体DNA提取方法

线粒体DNA（mtDNA）提取的核心思路是：先分离出完整、纯净的线粒体，再裂解线粒体，从中提取DNA。与核基因组DNA提取不同，mtDNA提取需要更温和的条件以保持线粒体结构的完整性。

以下是几种主要的提取方法，从经典实验室方法到试剂盒方案：

方法一：经典的分步离心法（差速离心 + 密度梯度离心）

这是最传统、纯度最高的方法，适用于对mtDNA纯度要求高的研究（如下一代测序）。

基本流程：

1. 组织或细胞破碎：

• 材料：新鲜或冷冻的组织（如肝脏、肌肉）或大量培养的细胞（如HeLa细胞）。

• 缓冲液：使用 匀浆缓冲液（含蔗糖或甘露醇以维持等渗，防止线粒体膨胀破裂；含EDTA螯合金属离子；含Tris-HCl维持pH；有时加入BSA保护线粒体膜）。

• 操作：在冰上操作，使用玻璃匀浆器或松紧合适的电动匀浆器温和破碎细胞，释放细胞器。

2. 差速离心去除杂质：

• 低速离心（~600 ×g， 4°C， 10分钟）：去除未破碎的细胞、细胞核、大的膜碎片。上清液包含线粒体、微粒体等。

• 高速离心（~11，000 ×g， 4°C， 10分钟）：沉淀线粒体。上清液（含核糖体、可溶蛋白等）弃去。

• 洗涤：将线粒体沉淀重悬于匀浆缓冲液，再次高速离心，重复1-2次以去除杂质。

3. 密度梯度离心（进一步提高纯度）：

• 将粗提的线粒体沉淀铺在 Percoll或蔗糖密度梯度液 上。

• 超速离心后，线粒体会在特定密度区带（约1.19 g/cm³）富集，而溶酶体、过氧化物酶体等细胞器位于其他区带。

• 收集线粒体区带，稀释后离心，得到高纯度线粒体。

4. 线粒体裂解与DNA提取：

• 将纯化的线粒体沉淀用 线粒体裂解液（含SDS、蛋白酶K）重悬，彻底裂解线粒体膜。

• 后续采用标准的 酚-氯仿抽提法 或 硅胶柱纯化法 去除蛋白质、RNA等杂质，沉淀或洗脱得到mtDNA。

• RNA酶处理是必要步骤，以去除丰富的线粒体RNA。

方法二：试剂盒法（最常用、最便捷）

目前大多数实验室使用试剂盒，它们基于改良的差速离心和柱纯化原理，简化了操作。

操作步骤

准备工作：在DNA 酶I 中加入600uL（50T）或者1100uL（100T）的DNA 酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min 的改为5min，但最后所得DNA 品质及产量可能会有一定影响。

1. 样本处理

• 组织匀浆：称取100~200 mg 新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS 或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL 冰预冷的细胞裂解液，0℃冰浴上下研磨组织20 次；

• 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS 洗涤，800×g 离心5~10 min收集细胞，计数。每次提取需要5×10⁷ 个细胞，加入1.0 mL 冰预冷的细胞裂解液重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g 离心5 min；

3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g 再次离心5 min；

4. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000 ×g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

5. 在线粒体沉淀中加入5 mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g 离心5 min；

6. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000 ×g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

7. 加入100μL DNA 酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μL DNase I 溶液（见准备工作），混匀，37 度水浴10min。此步为消化线粒体表面吸附的核DNA。4℃，12,000 ×g 离心5 min。尽可能的弃上清，再加入200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀，12,000 ×g 离心5 min，洗去残留的DNA 酶；

8. 得到的沉淀，用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀。加入10μL RNase A。加入200μL 线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1-2min 左右，不超过5min，再加入150μL 蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12,000 ×g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA；

9. 取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：可选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1 抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA 的损失，因而用于PCR 时可省，并不影响后续实验），加入6 倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5 倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10μL核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，12,000 ×g 离心10 min；

10. 弃上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，12,000 ×g 离心10 min。重复用70%乙醇洗一次；

11. 弃上清，再次离心1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-10 min；

12. 加入20-30μL TE 缓冲液，轻弹管底，37 ℃水浴5 分钟，线粒体DNA 溶解；

13. 进行DNA 电泳检测及-20 ℃保存，进行下步的实验。

方法三：碱裂解法（快速、适用于PCR）

适用于对纯度要求不高、只需快速检测mtDNA（如基因分型、缺失检测）的情况。

简要流程

1. 细胞或组织用碱性裂解液（如NaOH-SDS）直接裂解。

2. 用高盐溶液沉淀蛋白质和染色体DNA。

3. 上清中含有小分子的mtDNA（因其呈共价闭合环状，在碱性条件下变性后能迅速复性），可用异丙醇或乙醇沉淀出来。

4. 沉淀用70%乙醇洗涤后溶解。

关键注意事项与优化建议

1. 材料新鲜度：起始材料必须新鲜，或迅速冷冻于-80°C。线粒体在凋亡或坏死细胞中极易受损，导致mtDNA释放并降解。

2. 全程低温操作：除裂解和孵育步骤外，所有操作均在冰上进行，使用预冷的缓冲液和离心机，以抑制核酸酶活性。

3. 避免机械损伤：匀浆或涡旋力度要温和，过度剪切力会破坏线粒体。

4. 去除核DNA污染：

• DNase I 处理：是去除核污染最有效的手段。

• 长片段PCR验证：用特异性引物扩增一个长片段（如>8 kb）的mtDNA区域。如果核污染严重，长片段扩增会失败（核DNA在提取过程中易被剪切）。

5. 去除RNA污染：必须用 无DNase的RNase A 进行彻底消化。

6. 浓度与完整性检测：

• 琼脂糖凝胶电泳：纯净的mtDNA应在约16.5 kb处显示一条清晰条带（动物细胞）。出现拖尾或小片段表明降解；出现更高分子量条带可能为核DNA污染。

• 紫外分光光度计：检测A260/A280（~1.8）和A260/A230（>2.0）比值，评估蛋白质及盐等杂质污染。

• qPCR：使用核DNA和mtDNA的特异性引物进行定量，可以精确计算核DNA污染比例。

总结与选择建议

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