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发布人：武汉恩玑生命科技有限公司
发布日期:2026/2/25 11:43:48
常见的免疫检测技术中，根据所使用的试剂类型和检测原理，检测技术可分为直接检测和间接检测技术。如果荧光染料或可视化标记物标签直接连接到一抗上，则称为直接检测。如果一抗是未标记的，而标记物标签连接到另一分子上，例如二抗，则称为间接检测。直接检测技术和间接检测技术在不同的免疫学检测应用中能够发挥不同的作用，两种技术都有其优点和缺点，在选择最适实验方法时需要加以考虑。
直接法和间接法的比较：
直接法（标记一抗）
间接法（一抗 + 标记二抗）
适用性
适合检测高-中等表达的目标，因为单纯的一抗不会产生信号放大。
由于二抗提供的信号放大，适合研究低表达蛋白。
时间
偶联的一抗减少了所需的操作步骤，从而简化了实验流程。由于信号可视化来自偶联的一抗，因此只需对样品进行一轮孵育。
使用二抗会导致更长的实验步骤，因为需要额外的孵育步骤。在第一步中，您的样本必须与未标记的一抗孵育。在下一步中，与您感兴趣的标签连接的二抗将与一抗孵育以可视化抗原。
成本
偶联的一抗通常比二抗更贵。
二抗与一抗相比相对便宜，并且可以用来检测不同的一抗。
复杂性
方案中的步骤减少简化了二抗的使用，这意味着实验通常更容易设计。染料-抗体组合提供更大的灵活性来构建多重检测。
需要选择适当的二抗或多个对照，这增加了复杂性。在多重检测实验中这一点尤为重要，因为需要几种 不同物种来源的一抗，和几种相对应的二抗，每种连接到不同的染料。
物种交叉反应
在直接方法中，由于荧光团已经与一抗结合，因此种间交叉反应性被降到最低。
二抗可能会与其他物种发生交叉反应。使用预吸附的二抗可以防止交叉反应。
背景
使用直接法，背景会减少，因为一抗已经偶联，不太可能与样品中的其他抗原反应。
因为在实验中添加了额外的试剂，二抗可能会与其他抗原交叉反应，导致背景值更高。
主要应用领域
流式细胞术(FC)；
酶联免疫吸附（ELISA）；
荧光免疫组织化学（mIHC/mIF多通道）；
蛋白质印迹法(WB)；
免疫组化(IHC)；
荧光免疫组织化学（IF/IHC单通道）;
荧光免疫组织化学（mIHC/mIF多通道）；
荧光免疫细胞化学（IF/ICC单通道）;
酶联免疫吸附（ELISA）；
直接法和间接法用于不同的免疫检测技术领域的举例说明
1，荧光免疫组织化学
使用基于荧光素多重免疫检测方案如下图所示，说明使用直接法进行多重免疫荧光的优势。（除了下图所展示的实验方案之外，还有其他形式的多重免疫荧光实验技术）
使用间接染色方法进行多重荧光免疫组织化学利弊如下：
优点：
1）相较于使用偶联物进行直接检测亮度更强；
2）与标准染色实验步骤类似（甲醛固定的免疫荧光实验步骤）；
3）使用常见试剂，无需特殊成像设备；
缺点：
1）可用的一抗或二抗种属类型有限；
2）需要单独进行二抗孵育步骤；
针对其缺点的解决方案：EnkiLife可提供多种荧光标记的多种二抗类型，或提供标记试剂盒及标记技术服务，助力基于二抗的多重免疫检测技术的发展。
如果使用间接法检测且一抗是针对不同的抗原靶标，但是抗体来源的种属都是一样的，例如都是小鼠源一抗，二抗标记相对应的荧光染料，无论是什么二抗种属，都不能有效检测，而直接检测方法则避免了这个问题。图示如下：
使用直接IF染色法和偶联不同荧光团的抗体的利弊如下：
优点：
1）允许对在同一种属的不同抗体进行多重分析；
2）比间接检测更高效（无二抗检测步骤）；
3）类似于标准染色实验步骤（甲醛固定的免疫荧光实验步骤）；
4）使用常见试剂，无需特殊成像设备；
缺点：
1）亮度上比使用二抗进行的间接检测暗；
2）可用荧光团有限（通常需要更高亮度的荧光团）；
3）某些荧光团无商业形式提供，需要单独标记；
EnkiLife提供多种荧光标记试剂盒，标记方法简单，且具备较好的成本优势，可解决此种限制。
2、流式细胞术(FC)
使用流式细胞术检测的靶标通常是位于细胞表面的蛋白，生物体内不同的细胞具有不同的细胞表面蛋白的表达分布特征，例如中性粒细胞或者单核细胞，通常高表达FC受体（CD16/CD32）, 且很多细胞表面蛋白是属于免疫球蛋白超家族成员，使用间接检测方式，即使用荧光标记的二抗的方式通常会产生很高的背景信号。如果检测一种靶标，这种负面影响通常不会干扰实验结果的判断。但是流式细胞术的最大优势是其高通量多色实验的数据分析能力，由于使用二抗带来的影响，使用间接法检测多种靶标在细胞表面的表达特征或进行流式分选几乎变得不可能。
对比维度
直接检测
间接检测
标记方式
一抗直接偶联荧光基团（如FITC-抗CD4）
一抗无标记，二抗偶联荧光基团（如抗鼠IgG-FITC）
实验步骤
单步孵育（样本+荧光抗体）
两步孵育（样本+一抗 → 清洗 + 荧光二抗）
背景信号
低（非特异性结合少）
较高（二抗可能非特异性结合）
多色检测兼容性
高（易设计多色方案）
低（多色时二抗交叉反应风险高）
使用荧光标记的二抗进行流式检测通常会存在较大的非特异性染色或背景信号，如下图所示。
1:小鼠细胞悬液+ 不封闭+Fluor488-羊抗小鼠IgG;
2:小鼠细胞悬液+ rat anti mouse CD4+Fluor488-羊抗大鼠IgG;
3:小鼠细胞悬液+ Fluor488-羊抗大鼠IgG;
EnkiLife恩玑生命的创新抗体标记技术可确保对广泛靶标的准确检测和分析，目前我们已有40多种标记物试剂盒及技术服务可供选择，包括小分子荧光染料，生物素，酶，串联荧光染料、功能蛋白等，不同的抗体偶联标记上不同的标记物能够实现多种免疫学实验需求。
染料名称
试剂盒货号
Ex max/Em max
产品规格
相对荧光亮度
荧光颜色
Cyanine2
RE80019
490nm/510nm
40ug/200ug/2mg
★
绿色
Cyanine3
RE80007p
548nm/563nm
40ug/200ug/2mg
★
黄色
Cyanine5
RE80008p
646nm/662nm
40ug/200ug/2mg
★★★
红色
Cyanine5.5
RE80020
675nm/694nm
40ug/200ug/2mg
★★
深红
Cyanine7
RE80021
750nm/773nm
40ug/200ug/2mg
★★
深红
FITC
RE80001p
495nm/520nm
40ug/200ug/2mg
★★
绿色
Fluorescein-X
RE80022
495nm/519nm
40ug/200ug/2mg
★★
绿色
Fluor350
RE80009p
346nm/445nm
40ug/200ug/2mg
★
蓝色
Fluor405
RE80010p
400nm/424nm
40ug/200ug/2mg
★
紫色
Fluor430
RE80023
430nm/545nm
40ug/200ug/2mg
★
黄绿色
Fluor488
RE80011p
490nm/513nm
40ug/200ug/2mg
★★
绿色
Fluor532
RE80024
530nm/555nm
40ug/200ug/2mg
★★
黄绿色
Fluor555
RE80012p
555nm/572nm
40ug/200ug/2mg
★
黄色
Fluor568
RE80025
578nm/602nm
40ug/200ug/2mg
★★
橙色
Fluor590
RE80018
590nm/620nm
0.5mg/1.25mg/2.5mg
★
橙色
Fluor594
RE80013p
590nm/617nm
40ug/200ug/2mg
★★
橙色
Fluor647
RE80014p
651nm/668nm
40ug/200ug/2mg
★★★
红色
Fluor680
RE80015p
680nm/702nm
40ug/200ug/2mg
★★
深红
Fluor700
RE80026
702nm/723nm
40ug/200ug/2mg
★★
深红
Fluor750
RE80017p
747nm/770nm
40ug/200ug/2mg
★
深红
Fluor770
RE80016
770nm/790nm
0.5mg/1.25mg/2.5mg
★
深红
染料名称
试剂盒货号
Ex max/Em max
产品规格
相对荧光亮度
荧光颜色
R-PE
RE80005p
496nm,565nm/575nm
40ug/200ug/1mg
★★★★★
黄色
PE-Cy5
RE80036
496nm，565nm/668nm
40ug/200ug/1mg
★★★★★
红色
PE-Cy5.5
RE80038
496nm，565nm/696nm
40ug/200ug/1mg
★★★★
深红
PE-Cy7
RE80040
496nm，565nm/780nm
40ug/200ug/1mg
★★★★★
深红
PE-F594
RE80035
496nm，565nm/620nm
40ug/200ug/1mg
★★★★★
橙色
PE-F647
RE80037
496nm，565nm/668nm
40ug/200ug/1mg
★★★★★
红色
PE-F680
RE80039
496nm，565nm/700nm
40ug/200ug/1mg
★★★★
深红
PE-F750
RE80041
496nm，565nm/778nm
40ug/200ug/1mg
★★★★★
深红
APC
RE80006p
651nm/660nm
40ug/200ug/1mg
★★★★
红色
APC-Cy5.5
RE80031
651nm/696nm
40ug/200ug/1mg
★★
深红
APC-Cy7
RE80029
651nm/779nm
40ug/200ug/1mg
★
深红
APC-F680
RE80032
651nm/701nm
40ug/200ug/1mg
★★
深红
APC-F750
RE80030
651nm/778nm
40ug/200ug/1mg
★★
深红
PerCP
RE80027
481nm/675nm
40ug/200ug/1mg
★
红色
PerCP-Cy5.5
RE80033
481nm/676nm
40ug/200ug/1mg
★★
红色
PerCP-F680
RE80034
482nm/678nm
40ug/200ug/1mg
★★
红色
生物素种类
试剂盒货号
间隔臂(spacer arm)长度
产品规格
NHS-PEG4-Biotin
RE80002w
29.0埃
40ug/200ug/2mg
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin
RE80002u
30.5埃
40ug/200ug/2mg
Sulfo-NHS-LC-Biotin
RE80002s
22.4埃
40ug/200ug/2mg
Sulfo-NHS-SS-Biotin
RE80002v
24.3埃
40ug/200ug/2mg
Sulfo-NHS-Biotin
RE80002q
13.5埃
40ug/200ug/2mg
标记物种类: HRP
试剂盒货号: RE80004p
标记物分子量: 40000 D
产品规格: 80ug/400ug/4mg
试剂盒名称: 抗体中BSA 去除试剂盒
试剂盒货号: RE80028
产品规格: 1ml
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