文献分享：多重免疫荧光用于肿瘤组织免疫分析及细胞空间分布研究

一、研究背景

肿瘤免疫治疗虽发展迅速且成果显著，但恶性肿瘤可通过构建免疫抑制微环境逃避免疫监视，这一问题严重制约治疗效果。PD-1、CTLA-4等免疫检查点分子及其在肿瘤免疫逃逸中的作用被揭示后，明确免疫细胞与癌细胞的相互作用成为开发新型免疫疗法的核心前提。多重免疫荧光（mIF）是一种可靠的高通量方法，能够直接观察单个细胞表达的多种生物标志物，并分析不同细胞群体中这些标志物的空间关系，这是传统的免疫组织化学（IHC）技术无法实现的。因此，研究《Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue》通过组合精心筛选的抗体，可识别多种细胞亚群。采用酪氨酸信号放大（TSA）手动方案作为验证多重染色的标准参照 。通过自动化染色仪将最初手动方案 4-5 天的染色时间大幅缩短至 14-17 小时，同时提升了染色一致性。文献展示了自动化TSA染色的优化过程与可重复性，并在一小队列非小细胞肺癌（NSCLC）样本中，验证了其在肿瘤微环境研究及细胞表型空间分布分析中的应用价值。

二、研究方法

以福尔马林固定石蜡包埋的肺癌对照组织、人反应性扁桃体组织用于IHC、单一免疫荧光及mIF的优化与可重复性验证。非小细胞肺癌样本为研究对象，进行mIF染色和分析。先通过自动化染色系统优化CK、PD-L1、CD3 等系列标志物的免疫组织化学及单一免疫荧光条件，基于酪氨酸信号放大系统构建 5 组免疫肿瘤学多重免疫荧光面板，采用 Opal 荧光染料与自动化染色仪建立高效流程，缩短染色时间并提升一致性。随后对 NSCLC 样本进行mIF 染色，通过 Vectra-Polaris 3.0.3 多光谱成像系统扫描，由病理学家选取感兴趣区域，利用 InForm 软件进行细胞分割、表型定量及共定位分析，结合 R 语言脚本整合多面板数据，通过 Spearman 相关系数、变异系数评估技术可重复性，借助最近邻距离 G 函数与理论泊松函数对比分析细胞空间分布模式，同时关联患者临床病理特征探索数据关联性。

三、研究结果

1、NSCLC多重免疫荧光

非小细胞肺癌组织切片中，不同免疫肿瘤学检测组的多重免疫荧光图以及标志物共表达细胞的连线图，用来呈现细胞表型多样性。

2、NSCLC肿瘤微环境的表征

左侧图形是通过五个多重免疫荧光检测组所获取的不同细胞表型聚类的图形化展示。每个聚类代表一类具有特定标志物共表达模式的细胞亚群，不同聚类的区分体现了细胞表型的多样性。这种可视化方式能够直观反映出肿瘤微环境中各类细胞亚群的富集程度及相互关系，例如部分免疫抑制相关细胞表型可能会形成较为集中的聚类，而效应性 T 细胞相关表型则可能呈现另一类聚类特征。右侧明确列出了通过五个 mIF 检测组预期观察到的细胞表型，这些表型是基于各检测组的标志物组合预先定义的。涵盖了恶性细胞CK+相关表型、T 细胞亚群表型、巨噬细胞相关表型以及髓系来源抑制细胞相关表型等，全面覆盖了肿瘤微环境中关键的细胞群体。

3、探索NSCLC的细胞空间关系

非小细胞肺癌样本的空间分析结果图通过可视化方式呈现了恶性细胞CK+与各类免疫细胞表型之间的距离关系，所有距离测量均以 CK + 恶性细胞为中心，设定 200 微米为半径，直观区分靠近恶性细胞和远离恶性细胞的细胞群体。为解析肿瘤微环境中细胞的空间分布特征及相互作用提供了直观依据，清晰展示了各类细胞在肿瘤组织中的相对位置。

图中对应 5 个 mIF 检测组，分别聚焦不同细胞群体间的距离关系。Panel 1 和 2展示 CK + 恶性细胞与不同 CD3+T 细胞表型（根据标志物表达以不同颜色点标识）、CD68 + 巨噬细胞的距离关系。Panel 3呈现表达不同免疫检查点标志物的 CK + 恶性细胞与 CD3+T 细胞的距离关系。Panel 4展示 CK + 恶性细胞与表达不同免疫检查点标志物的 CD3+T 细胞的距离关系。Panel 5呈现 CK + 恶性细胞与不同 CD68 + 巨噬细胞表型及其他髓系来源抑制细胞表型的距离关系。

研究还以热图形式量化 CK + 恶性细胞及表达不同免疫检查点标志物的 CK + 恶性细胞，与各类免疫细胞表型的中位邻近程度。颜色深浅直观反映距离远近，颜色越深代表细胞间中位距离越近，相互作用可能性越高，颜色越浅则代表距离越远，互作概率越低。

4、探索NSCLC的细胞空间分布模式

通过单个最近邻距离 G 函数和理论泊松曲线图谱，分析 CK + 恶性细胞与 CD3+T 细胞之间的距离分布模式，并展示每种模式对应的主要细胞表型。a、b图都包含三部分，左侧是判断混合和非混合模式的评分标准和阈值，中间是 CD3+T 细胞与 CK + 细胞的分布示意图，右侧是最近邻距离 G 函数和理论泊松曲线的对比区域。其中a是 CD3+T 细胞相对 CK + 细胞的混合模式分布，b是非混合模式分布。c用图形模型展示了两类细胞互作特征，抑制性细胞表型评分＜10，呈混合模式，与恶性细胞互动更紧密。细胞毒性 T 细胞CD3+CD8+和细胞毒性记忆 T 细胞CD3+CD8+CD45RO+评分＞10，呈非混合模式，与恶性细胞互动较弱。此发现为解析肿瘤微环境中细胞互作机制及与肿瘤进展的关联提供了关键依据。

四、总结

本研究通过优化自动化mIF面板及分析流程，为肿瘤免疫微环境的高效、精准解析提供了技术方案，同时在NSCLC中识别出B7-H4、OX40等潜在靶点及特征性空间分布模式，为免疫治疗的个体化策略制定提供了重要依据。尽管存在样本量小、可重复性验证不充分等局限，但该研究建立的技术范式与研究发现，对肿瘤免疫领域的基础研究与临床转化具有重要参考价值。

参考文献

Parra ER, Ferrufino-Schmidt MC, Tamegnon A, Zhang J, Solis L, Jiang M, Ibarguen H, Haymaker C, Lee JJ, Bernatchez C, Wistuba II. Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue. Sci Rep. 2021 Apr 19;11(1):8511. doi: 10.1038/s41598-021-88156-0. PMID: 33875760; PMCID: PMC8055659.

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