如何避免ELISA非特异性结合

非特异性结合是ELISA实验中常见的问题，表现为阴性对照孔出现明显信号、高背景值或假阳性结果，严重影响数据准确性。它通常由抗体浓度过高、样本杂质干扰、封闭不充分或洗涤不彻底等因素引起。解决这一问题需要系统性地排查并优化各个环节。

主要应对措施（按操作环节分类）

1、选择高质量封闭剂

使用5% BSA、脱脂奶粉或专用封闭缓冲液（如ChonBlock™）饱和未结合位点。

避免使用可能含交叉反应成分的封闭剂，例如某些BSA可能含有牛免疫球蛋白杂质。

可将封闭剂添加至样本稀释液中以进一步抑制干扰。

2、优化抗体浓度与孵育条件

进行抗体滴定实验，找到最佳工作浓度，避免因抗体过量引发非特异性吸附。

控制孵育时间和温度，防止长时间孵育增加非特异性结合风险。

3、强化洗涤步骤

每步反应后使用含0.05%-0.1% Tween-20的PBS（PBST）彻底清洗3–5次。

确保洗板充分，去除未结合分子，降低背景噪声。

4、选用高特异性抗体与阻断剂

优先使用单克隆抗体或经过验证的配对抗体对，提高检测特异性。

添加异嗜性抗体阻断剂（如鼠源IgG片段），消除人源样本中天然抗体的干扰。

在检测前排除异嗜抗体影响，尤其用于临床相关研究时。

5、调整实验设计

若使用间接法存在交叉风险，可考虑改用直接法ELISA，虽灵敏度较低但避免了二抗带来的非特异性结合。

对于多表位抗原，推荐双抗体夹心法，因其具有更高的特异性和信号稳定性。

以下表格总结了不同策略的作用机制与实施要点：

特别说明：部分非特异性结合源于样本本身，如类风湿因子（RF）、补体或细菌污染（如HRP样酶活性）。因此，应确保样本新鲜、无溶血或污染，并避免反复冻融。

建议

为系统性降低非特异性结合风险，建议按以下流程操作：

预实验优化：对抗体浓度、封闭液类型和洗涤条件进行梯度测试；

设置对照：包括空白对照、阴性对照和非特异性结合对照（如无一抗组）；

使用高质量耗材：选择认证过的ELISA板和洁净枪头，避免污染；

数据分析时扣除本底：将阴性对照信号作为背景值进行校正。