一个受体，千种可能：GPCR如何成为跨界“万能靶点”？

发布人：上海优宁维生物科技股份有限公司

发布日期:2025/12/12 15:27:09

G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）是最大的细胞表面膜受体超家族，由约1000个基因编码，具有保守的七次跨膜（7TM）螺旋结构。GPCR广泛存在于人体各个组织和器官中。它们在细胞与外界环境之间传递信号，调控细胞的许多基本功能，包括感知光线、味道、气味以及调节心跳、血压、免疫反应等生理过程。简单来说，GPCR就像细胞的“接收器”，它们感知体内外的各种信号（比如激素、神经递质、药物等），并将这些信号转化为细胞内的反应。由于其在生理和病理过程中的重要性，GPCR成为了现代药物研发的一个重要靶点。

一、GPCR的作用与分类

1．感官受体： 如视网膜中的光感受器、鼻腔中的嗅觉受体等。

2．代谢受体： 调控体内能量代谢、糖尿病、肥胖等的药物靶点。

3．神经递质受体： 对神经递质如多巴胺、去甲肾上腺素等的信号传导起作用，许多神经精神疾病（如抑郁症、精神分裂症）的治疗靶点。

4．免疫系统受体： 在免疫反应和炎症中发挥重要作用，许多免疫疾病（如类风湿性关节炎）与此相关。

5. 激素受体： 包括肾上腺素受体、肾上腺皮质激素受体等，参与调节心血管、内分泌等功能。

二、GPCR与药物

由于GPCR在多种生理和病理过程中扮演着至关重要的角色，因此它们是药物研发的核心靶点之一。当前大约30%–40%的药物直接作用于GPCR，涵盖了抗高血压、抗过敏、抗精神病等多种药物。大多数GPCR药物为小分子（约92%），而非抗体等生物模式。GPCR的药物研究需要关注其激动剂或拮抗剂的筛选、信号通路的激活与抑制、受体与配体的结合亲和力等方面。

药物作用方式：

激动剂：这类药物通过与GPCR结合，激活受体，引发一系列细胞内信号转导反应。比如β-受体激动剂用于治疗哮喘。

拮抗剂：拮抗剂与GPCR结合，但不激活它，而是阻止其激活，从而中断某些生理反应。例如，抗高血压药物常通过拮抗某些GPCR来降低血压。

偏向性激动剂/拮抗剂：这类药物能够选择性地激活或抑制受体某些特定的功能。这是现代GPCR药物研究的热点之一，因为它能够减少副作用，提高药物的疗效。

三、GPCR与药物研发

随着GPCR靶向药物的不断研发，如何高效、精准地检测GPCR的活性、受体信号传递以及药物的作用效果，已成为推动药物研发的重要技术环节。GPCRs历来是高通量筛选（HTS）最常筛选的目标。

HTS是一种用于快速识别药物靶点的方法，可以对数十万种化合物进行靶标筛选。成功的HTS需要大量基础设施，包括结构多样的小分子库，以及信息学和生物学等多个科学学科的整合。HTS检测必须经过充分验证，以确保其高度可重复、稳健、低成本且兼容检测自动化。

GPCR HTS最常用的方法包括研究受体激活下游的细胞内活动。例如，这些方法测量第二信使，如Ca2+、cAMP（环腺苷单磷酸）、IP1（肌醇单磷酸）和pERK（磷酸细胞外信号调控激酶）、基因表达报告细胞，以及β-抑制素的招募到GPCR。

1.第二信使：cAMP（环磷酸腺苷）/ Ca²⁺/ IP1（肌醇单磷酸）

现在已有许多兼容HTS的检测技术可以测量这些GPCR第二信使。TR-FRET（均相时间分辨荧光）能够持续产生高质量数据，采用均质检测，信号和试剂稳定性优异，兼容测验自动化，且兼容384和1536孔板。

以 cAMP 为例

THUNDER™ cAMP检测是用于定量测定细胞裂解液中的3′，5′-环单磷酸腺苷（cAMP），基于均相TR-FRET技术，兼容各种物种的贴壁细胞和悬浮细胞，具有简单，快速和灵敏的优势。试剂盒基于竞争法，标记荧光供体和受体的cAMP抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，已经与带有Biotin标签的cAMP结合，形成复合物，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，细胞裂解液中的游离cAMP会与Biotin-cAMP竞争，与抗体FR-Ab2结合，阻断信号产生，荧光信号强度与游离cAMP浓度成反比。全程仅需1h，免洗，可高通量。

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图：cAMP检测原理，标曲及流程

每次实验应包括cAMP标准曲线，以验证该分析是否产生预期的IC50值和S/B比，并将TR-FRET信号转换为cAMP水平。

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图：表达内源性Gs偶联腺苷A2a受体的U266B1细胞（2000个细胞/孔）中

激动剂浓度-反应曲线（图左）和拮抗剂浓度-反应曲线（图右）

G蛋白偶联受体的下游信号通路多样，具体的信号传递通路取决于α亚基的类型（Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13）。

● Gs / Gi → 检测cAMP。检测方法：THUNDER™ cAMP TR-FRET检测

● Gq → 检测Ca²⁺。检测方法：钙流检测。Fluo-8免洗细胞钙流检测试剂盒（abs50199-100T）

图：GPCR的信号传导

From: https://www.ktsmo.com/news2/info.aspx?itemid=421

2.下游磷酸化/转录因子

以Phospho-ERK为例

THUNDER TR-FRET时间分辨荧光共振能量转移，检测技术灵敏度高，特异性好，重复性好，操作简单，仅需1~4h。一种基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技术，采用夹心法，检测胞内ERK磷酸化水平和总ERK水平。

图. THUNDER磷酸化蛋白检测原理示意图

用EGF处理HEK293细胞（50,000个细胞/孔）室温下孵育10分钟。数据显示，EGF刺激ERK1/2在T202/Y204点位的磷酸化。用抑制剂Erlotinib处理HEK293细胞（50,000个细胞/孔），在室温下孵育15分钟，然后用0.5nM EGF刺激细胞，在室温下孵育10分钟。数据显示，Erlotinib可以抑制ERK1/2在T202/Y204点位的磷酸化。

图. THUNDER Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)验证数据

3.基因表达报告细胞

以双荧光素酶报告基因检测为例

图. 双荧光素酶报告基因检测验证数据

HEK293细胞接种于96孔白板透明底培养板，100µl/孔，细胞密度为60%。隔日转染 pCMVFluc 及 pCMV-Rluc 质粒，每孔0.2µg DNA，48小时后检测双荧光素酶活性。图中数值代表4孔重复平均值。A: 加了R1试剂后的荧光读数；B：加入R1试剂读值后，继续加 R2 缓冲液(无底物)后的荧光读数；C：加入R1试剂读值后，继续加R2 1x 工作液后的荧光读数。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kD 的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化萤光素生成氧化萤光素（Oxyluciferin），在萤光素被氧化的过程中，会产生光信号。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素氧化成肠酰胺（Coelenteramide），在腔肠素氧化的过程中也会产生光信号。本试剂盒的光信号可以通过化学发光仪、酶标仪或液闪测定仪进行测定。该试剂盒具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广，无细胞内源活性干扰等特点。

4. β-Arrestin 募集和内化（偏向性信号）

通过GPCR激活的信号通路取决于GPCR本身的一级序列和三级结构，但最终由特定配体稳定的特定构象以及参与的信号转导分子决定。目前，GPCR被认为主要使用两种类型的信号转导分子：G蛋白和β-arrestins 。因为β-arrestin仅对磷酸化形式的GPCR具有高亲和力，所以大多数信号转导最终由G蛋白激活介导。

5. 受体-配体互作：亲和力检测

SPR因其通量、灵敏度以及能够表征mM至亚pM范围内结合分子的能力，以及标准实验中常规提供的信息量，是药物发现流程中的热门应用。除了亲和力和靶点结合数据外，还可以评估化学计量和其他结合行为（异常动力学、非特异性结合等），如HTS筛查、微分裂荧光素酶活细胞内检测。

HTS筛查可采用配体竞争结合的方法，利用样本中待测抗原与已知浓度的标准抗原之间的竞争关系来进行检测。

微分裂荧光素酶技术（Nanoluc Split Enzyme Technology）将微荧光素酶(NanoLuc)分成两个不同的片段：大片段和小片段，两个片段单独不具有酶活性，而大小片段结合后恢复微荧光素酶活性。大小两个片段可以具有高亲和力或低亲和力不同组合。高亲和力大小片段在同一反应体系中可以快速结合为具有酶活性的微荧光素酶，而低亲和力大小片段可以借助其标记的两个目标蛋白的结合而成为具有酶活性的微荧光素酶。检测微荧光素酶大片段和小片段结合所致的微荧光素酶活性可以用于细胞蛋白的表达，调控和降解以及蛋白相互作用等领域的研究。

UA-Glo® Nano-luc Live Cell Assay System（UA：UA070110）微荧光素酶活细胞内检测试剂盒包括可以进入细胞的微荧光素酶底物和缓冲液，可以不裂解细胞检测活细胞内微荧光素酶大小片段结合后产生的微荧光素酶活性，也可以检测微荧光素酶在活细胞中的表达。该试剂盒具有检测灵敏度高，背景低，检测范围广，检测信号稳定（半衰期约3hr）的优点，特别适合化合物的高通量筛选。