河北贞田食品添加剂有限公司

                                        索马甜检验方法

求时，均按 GB/T 601、GB/T 602 和GB/T 603 之规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。

A. 2 鉴别试验

A. 2. 1 溶解性

极易溶于水。

A. 2. 2 高效液相色谱图对照

高效液相色谱图与附录B 图 B.1 给出的索马甜高效液相典型色谱图一致。

A. 2. 3 pH

1%样品溶液的pH为2.5～4.0。

A. 3 索马甜含量的测定

A. 3. 1 测定原理

用离子交换色谱法和紫外检测以外标校准法确定高效液相色谱含量。

A. 3. 2 试剂和材料

高效液相色谱级水。

A. 3. 3 仪器和设备

A. 3. 3. 1 配有紫外-可见检测器的高效液相色谱仪,或类似仪器。

A. 3. 3. 2 高效液相色谱柱，8 x 75 mm，8µm，或类似色谱柱。

A. 3. 3. 3 超声波浴。

A. 3. 3. 4 分析天平。

A. 3. 3. 5 用于高效液相色谱分析的2 mL自动进样器样品瓶。

A. 3. 3. 6 10 mL，50 mL 和 100 mL棕色容量瓶。

A. 3. 3. 7 5 mL和10 mL 移液管。

A. 3. 3. 8 0.45 µm 针式过滤器。

A. 3. 4 色谱分析条件

推荐的色谱柱及典型操作条件见表A.1。其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱操作条件均可使用。

表 A. 1 色谱柱和典型色谱操作条件

A. 3. 5 分析步骤

A. 3. 5. 1 流动相

A: 0.02M 磷酸钠缓冲液, pH 8.80 (Na₂HPO₄)

B: 缓冲液 A + 1 M(mol/L) NaCl

A. 3. 5. 2 公称压力

本方法允许的压力范围是4 Mpa±0.2 Mpa。

A. 3. 5. 3 系统适应性试验

A. 3. 5. 3. 1 步骤

用流动相平衡高效液相色谱系统至少10 min，注入稀释液作为空白以确认无干扰峰及无拖尾现象，把用不同量样品配制的5种溶液各注入一次，确认各图谱中索马甜蛋白的峰面积以及保留时间，如表A.2中所示。

表 A. 2 各组分的近似保留时间

A. 3. 5. 3. 2 样品中各成分的线性度

确认样品溶液中索马甜的校正因子(峰面积对比样品中成份浓度)，各化合物的曲线校正因子不得小于0.995，样品曲线的相对标准偏差百分比不得大于 2%。

A. 3. 5. 4 测定

A. 3. 5. 4. 1 索马甜标准品的校准曲线

精确称取约5 mg 索马甜标准品于 100 mL容量瓶内(标准溶液 A)；4 mg 索马甜标准品于50 mL容量瓶内(标准溶液B)；5 mg 索马甜标准品于 10 mL容量瓶内(标准溶液C)；取标准溶液各5 mL于10 mL容量瓶内；用水定容(标准溶液A₁; B₁; C₁)，标准溶液A₁; B₁; C₁以及线性标准溶液各进样20 µl。根据直线回归分析计算各成分的校准曲线，按式（A.1）:

A = a × (c × P) + b （A.1）

式中：

A——各成份的峰面积； c——各成份的浓度(g/L)；

(=索马甜浓度x标准液中各成分的再分配比例 (%))

a——回归直线斜率； b——回归直线的y轴截距；

P——索马甜标准品的纯度。

A. 3. 5. 4. 2 索马甜产品样品的制备

饮料及粉末状提取物样品制备：精确称取约 100 mg 样品(根据样品中索马甜含量调整取样量)，用水稀释至 50 mL，超声波振荡10 min，再将其冷却至室温，用针式过滤器过滤至高效液相色谱样品瓶内并加盖。

A. 3. 5. 5 计算结果

A. 3. 5. 5. 1 索马甜1，索马甜2，索马甜3的含量以T_X计，数值以%表示，按式（A.2）计算：

T_X% = [A_X－b] / [a×c] （A.2）

式中：

T_X——索马甜1或索马甜2或索马甜3的含量（%）； A_X——索马甜1或索马甜2或索马甜3的面积； c——各成份的浓度(g/L)；

a——回归直线斜率； b——回归直线的y轴截距。

A. 3. 5. 5. 2 索马甜的含量以T计，数值以%表示，按式（A.3）计算：

T% = T₁% +T₂%+T₃% （A.3）

式中：

T——索马甜含量（%）； T₁——索马甜1含量（%）； T₂——索马甜2含量（%）； T₃——索马甜2含量（%）。

A. 4 比吸收率的测定

A. 4. 1 测定原理

在波长(典型波长为279 nm)处进行分光光度法检测。

A. 4. 2 试剂和材料

A. 4. 2. 1 浓盐酸，分析纯。

A. 4. 2. 2 去矿物质/去离子水（相当于GB6682中的二级水）。

A. 4. 3 仪器和设备

A. 4. 3. 1 双光束紫外/可见分光光度计。

A. 4. 3. 2 光路为10 mm的石英比色皿。

A. 4. 3. 3 容量瓶。

A. 4. 3. 4 移液管。

A. 4. 3. 5 分析天平。

A. 4. 3. 6 巴氏移液管。

A. 4. 3. 7 pH 计。

A. 4. 4 分析步骤

A. 4. 4. 1 用去矿物质/去离子水(相当于GB6682中的二级水)做空白液，盐酸调pH值至2.5。

A. 4. 4. 3 精确称取约0.5 g索马甜于50 mL容量瓶中，用适量的已用盐酸调pH值至2.5的去矿物质/去离子水(相当于GB6682中的二级水)溶解，用巴氏移液管补加并准确定容至50 mL。

A. 4. 4. 4 取5 mL索马甜样品溶液于100 mL容量瓶中，用空白溶液定容。

A. 4. 4. 5 将空白样品置于样品比色皿和参比比色皿中，在250 nm～300 nm间对分光光度计进行背景校正。

A. 4. 4. 6 将空白液从样品比色皿中倒出，用少量稀释过的索马甜溶液冲洗比色皿，之后加入稀释过的索马甜样品溶液，在279 nm附近的主峰处读取吸光度数据。

A. 4. 5 计算结果

吸收度按式（A.4）计算：

C×20 （稀释倍数）×100S   =(100- W) × WCF

…………………（A.4）

…………………（A.5）

S—— 吸 收 度 ； C——0.05%，索马甜吸收率；

W——索马甜水分含量（%）；

WCF——重量校正因子，按式（A.5）计算； W_T——实际使用的索马甜样品质量(g)。

A. 5 吸光度的测定

A. 5. 1 试剂和材料

浓盐酸，分析纯。

A. 5. 2 仪器和设备

A. 5. 2. 1 双光束紫外/可见分光光度计。

A. 5. 2. 2 光路长为10 mm的石英比色皿。

A. 5. 2. 3 50 mL 容量瓶。

A. 5. 2. 4 分析天平。

A. 5. 2. 5 巴氏移液管。

A. 5. 2. 6 pH计。

A. 5. 3 分析步骤

A. 5. 3. 1 用去矿物质/去离子水做空白液，盐酸调pH值至2.5。

A. 5. 3. 2 打开分光光度计，预热10 min。

A. 5. 3. 3 精确称取约0.5 g索马甜于50 mL容量瓶中，用适量的已用盐酸调pH值至2.5的去矿物质/去离子水溶解，用巴氏移液管补加并准确定容至50 mL。

A. 5. 3. 4 将空白样品置于样品比色皿和参比比色皿中，在300 nm～600 nm间对分光光度计进行背景校正。

A. 5. 3. 5 将空白液从样品比色皿中倒出，用少量索马甜溶液冲洗比色皿，之后加入索马甜溶液，读取分光光度计吸光数值 (A₄₂₀)。

A. 5. 4 计算结果

吸光度按式（A.6）计算：

C A (A420) ×100……………（A.6）

式中：1%

10mm

420nm ) =

(100- W) × WCF

C——吸光度；

A——1% 索马甜样品的吸收率；

W——索马甜水分含量（%）；

WCF ——重量校正因子，按式（A.5）计算。

A. 6 碳水化合物的测定A. 6. 1 试剂和材料

A. 6. 1. 1 硫酸。

A. 6. 1. 2 L-半胱氨酸盐酸一水合物。

A. 6. 1. 3 盐酸。A. 6. 2 仪器和设备

A. 6. 2. 1 双光束紫外/可见分光光度计。

A. 6. 2. 2 光路长为10 mm的1 mL一次性塑料半微量比色皿。

A. 6. 2. 3 75 ×10 mm 一次性试管。

A. 6. 2. 4 50 mL容量瓶。

A. 6. 2. 5 50 mL量筒。

A. 6. 2. 6 100 mL锥形烧瓶。

A. 6. 2. 7 50 mL容量瓶。

A. 6. 2. 8 旋涡混合机。

A. 6. 2. 9 电加热水浴。

A. 6. 2. 10 1 mL可调容积的吸管。

A. 6. 2. 11 吸头盒。

A. 6. 2. 12 分析天平。

A. 6. 2. 13 巴氏移液管。

A. 6. 2. 14 pH计。

A. 6. 3 标准曲线制备

用0.2 mL的10 mg/mL～100 mg/mL的葡萄糖溶液按上述方法检测，制备标准曲线。根据此标准曲线计算碳水化合物含量。

A. 6. 4 分析步骤

A. 6. 4. 1 用硫酸制备86% (v/v) 硫酸溶液。

A. 6. 4. 2 制备3% (w/v) L-半胱氨酸盐酸一水合物水溶液。

A. 6. 4. 3 打开分光光度计预热10 min。调整仪器设置以检测412 nm处的吸光度。

A. 6. 4. 4 精确称取约0.2 g索马甜于100 mL容量瓶中，用适量的去矿物质/去离子水（pH值2.5） 溶解，用巴氏移液管补充并准确定容至100 mL。

注：准确定容至50 mL前不要摇动容量瓶溶解索马甜。

A. 6. 4. 5 打开水浴加热至沸腾。

A. 6. 4. 6 使用前配制半胱氨酸-硫酸试剂，配制方法为：取 0.5 mL3% (w/v) L-半胱氨酸盐酸一水合物溶液与25 mL86% (v/v) 硫酸在100 mL锥形烧瓶中混合。在冰浴中冷却。

A. 6. 4. 7 取0.2 mL索马甜溶液于一次性试管内，制备一套四个索马甜样品。

A. 6. 4. 8 用0.2 mL去矿物质/去离子水（pH2.5）制备一套空白液。.

A. 6. 4. 9 用吸管向空白和样品中各加1.2 mL冰半胱氨酸-硫酸试剂，用旋涡混合机彻底混匀， 在冰中放置2min后移至室温放置3min，之后浸入沸水中3min。

A. 6. 4. 10 空白液和样品溶液在冰中冷却5min。

A. 6. 4. 11 将空白液置于样品比色皿和参比比色皿对分光光度计调零。

A. 6. 4. 12 拿出含空白液的样品比色皿，另放入一个含索马甜样品的比色皿，读取吸光度数值 (E412)。重复检测每套的样品取平均值。

A. 7 硫酸灰分的测定

A. 7. 1 试剂和材料

浓硫酸，分析纯。

A. 7. 2 仪器和设备

A. 7. 2. 1 铂坩埚。

A. 7. 2. 2 干燥器。

A. 7. 2. 3 坩埚钳。

A. 7. 3 分析步骤

A. 7. 3. 1 精确称取约1.0 g样品于已预先灼烧、冷却并称重的铂坩埚内，每个样品分三份检测。

A. 7. 3. 2 向每个坩埚内加入约40滴浓硫酸。

A. 7. 3. 3 将坩埚置于处于低温的熔炉内，在4 h～5 h内逐渐升温至550 ℃±10 ℃，在该温度范围维持约5 h。

A. 7. 3. 4 取出坩埚，待冷却后向残留物中再加入5滴浓硫酸。炉温降至100 ℃以下时，再将坩埚置于炉内，在3 h～4 h内缓慢升温至550 ℃左右，维持1 h。

A. 7. 3. 5 将坩埚取出置于干燥器内，冷却后重新称重，计算每一份样品的硫酸灰份残渣重量。

A. 7. 4 计算结果

硫酸灰分含量以A计，数值以%表示，按式（A.7）：

A% =式中：

A——硫酸灰分含量(%)； W_A——硫酸灰分重量；

W_B——索马甜水分含量（%）。

W_A × 100% W_B

…………………（A.7）

A. 8 总氮的测定

A. 8. 1 分析步骤

A. 8. 1. 1 精确称取约0.5 g索马甜于已配衡无灰滤纸上，仔细折叠滤纸以包好样品，之后倒入烧瓶中，向烧瓶内加少许防崩沸颗粒、2片硒催化剂及20 mL硫酸。

A. 8. 1. 2 将烧瓶置于消化单元内加热约2 h，直至内容物变成灰白或不透明。

A. 8. 1. 3 关掉仪器冷却15 min，从消化单元移走烧瓶，冷却至室温，加约10 mL冲洗烧瓶壁。

A. 8. 1. 4 将烧瓶置于蒸汽蒸馏单元，加入足量的32% NaOH溶液中和剩余的酸，蒸汽蒸馏4 min，馏出物进入预先加入40 mL的2%硼酸溶液和6滴甲基红屏蔽指示剂的锥形烧瓶。

A. 8. 1. 5 用已知浓度的稀盐酸滴定馏出物至刚好粉红色，盐酸浓度约为25 M （mol/L）

A. 8. 2 计算结果

总氮含量以P计，数值以%表示，按式（A.8）计算：

P% N% =6.25………………………（A.8）

其中 P% =  W

式中：

N——氮含量(%)；

P——蛋白质含量（%）； M_A——酸的摩尔浓度(mol/L)； T——滴定量(mL)；

W——样品质量（mg）。

A. 9 铝的测定

A. 9. 1 使用范围和领域

A. 9. 1. 1 本标准检测方法详细列出了原子吸收光谱法检测铝含量的步骤。

A. 9. 1. 2 本方法适用于检测液体和固体样品。

A. 9. 2 测定原理

从样品中精确称取部分有代表性的样品先用本生灯灰化，再放入约500℃的马弗炉中， 残渣用浓盐酸溶解，用原子吸收光谱法检测铝含量。

A. 9. 3 试剂和材料

A. 9. 3. 1 盐酸。

A. 9. 3. 2 10% v/v 盐酸：用蒸馏水将浓盐酸稀释10倍（量筒的精确度即可）。 配好的试剂应储存于玻璃容器中，保质期为6个月。

A. 9. 3. 3 氯化镧。

A. 9. 3. 4 2% w/v氯化镧溶液：用5% v/v的盐酸溶解26.8 g氯化镧并稀释至500 mL。配好的试剂应储存于玻璃容器中，保质期为3个月。

A. 9. 3. 5 1000 mg/L ± 5 mg/L铝标准液 (原子吸收光谱法用标准溶液)。

A. 9. 4. 1 石英坩埚。

A. 9. 4. 2 分析天平。

A. 9. 4. 3 本生灯、石棉替代垫、三角架和陶制三角架。

A. 9. 4. 4 马弗炉运行温度500 ℃± 25 ℃。

A. 9. 4. 5 量筒。

A. 9. 4. 6 容量瓶。

A. 9. 4. 7 配聚乙烯螺纹盖的聚乙烯瓶。

A. 9. 4. 8 原子吸收分光光度计或类似仪器。

A. 9. 5 分析步骤

A. 9. 5. 1 固体样品的测定用样品溶液制备

A. 9. 5. 1. 1 对样品进行均质处理。

A. 9. 5. 1. 2 精确称取不低于5 g样品于石英坩埚内，样品重量精确到0.1 mg，同时用空石英坩埚做空白样品进行检测。

A. 9. 5. 1. 3 将坩埚放在电炉上加热以除去水分，之后用小火加热直至内容物完全碳化。

A. 9. 5. 1. 4 将坩埚移至马弗炉中，在500℃± 25 ℃灰化4 h～24 h，直至样品灰化成为浅灰色

/白色。

A. 9. 5. 1. 5 冷却后加入10 mL蒸馏水(足够湿润灰份)和5.0 mL浓盐酸。盖上表面皿在蒸汽浴中加热30 min。

A. 9. 5. 1. 6 冷却后用蒸馏水将坩埚内容物移入50 mL容量瓶中。用移液管加入约5 mL的2%

氯化镧溶液。稀释定容并混匀。

A. 9. 5. 2 加标样品制备

A. 9. 5. 2. 1 精确称取不低于5 g样品于石英坩埚内，样品重量精确到0.1 mg，加入1 mL的1000 mg/L铝标准溶液。根据A.9.6.2描述的方法计算回收率。

注：根据样品基质中铝含量可能需调整加标量。

A. 9. 5. 2. 2 重复A.9.5.1.3及后续步骤进行制备。

A. 9. 5. 3 液体样品的测定用样品溶液制备

A. 9. 5. 3. 1 用移液管量取适量的样品于50 mL容量瓶中。用移液管加入约5 mL的2%氯化镧溶液，用10% v/v盐酸稀释定容。

A. 9. 5. 3. 2 本测定用样品溶液中铝含量应低于1.0 mg/L。

A. 9. 5. 3. 3 用10% v/v盐酸做空白样品。

A. 9. 5. 4 制备质量控制溶液

A. 9. 5. 4. 1 向100 mL容量瓶中移入300 µL的1000 mg/L ± 5 mg/L 铝标准液。用10% v/v盐酸稀释定容，得3.0 mg/L铝标准液。

A. 9. 5. 4. 2 该3.0 mg/L铝标准液应该与测定用样品溶液同时新鲜配制。

A. 9. 5. 5 制备标准曲线溶液

A. 9. 5. 5. 1 标准空白溶液。

A. 9. 5. 5. 2 向200 mL容量瓶中移入10 mL的2%氯化镧溶液，用10% v/v盐酸稀释定容。

A. 9. 5. 5. 3 校正用标准溶液 1

A. 9. 5. 5. 4 向1 L容量瓶中移入1.0 mL的1000 mg/L铝标准溶液，用移液管加入100 mL的2%

氯化镧溶液，用10% v/v盐酸稀释定容，得1.0 mg/L铝标准溶液。

A. 9. 5. 5. 5 校正用标准溶液 2

A. 9. 5. 5. 7 校正用标准溶液 3

A. 9. 5. 5. 8 向1 L容量瓶中移入3.0 mL的1000 mg/L铝标准溶液，用移液管加入100 mL的2%

氯化镧溶液，用10% v/v盐酸稀释定容，得3.0 mg/L铝标准溶液。

A. 9. 5. 5. 9 校正用标准溶液 4

A. 9. 5. 5. 10 向500 mL容量瓶中移入2.0 mL的1000 mg/L铝标准溶液，用移液管加入100 mL

的2%氯化镧溶液。用10% v/v盐酸稀释定容，得4.0 mg/L铝标准溶液。

A. 9. 5. 5. 11 校正用标准溶液 5

A. 9. 5. 5. 12 向1 L容量瓶中移入5.0 mL的1000 mg/L铝标准溶液，用移液管加入100 mL的2%氯化镧溶液，用10% v/v盐酸稀释定容，得5.0 mg/L铝标准溶液。

A. 9. 5. 5. 13 标准空白和校正用标准溶液应该存放于配聚乙烯螺纹盖的聚乙烯瓶中保存。

A. 9. 5. 6 分析步骤

A. 9. 5. 6. 1 使用原子吸收分光光度计进行检测分析，制备标准曲线。

A. 4. 4. 1. 1. 1 注：重复进行仪器校正直到每次测得的校正含量的平均值在铝含量的± 10%以内。

A. 9. 6 计算结果

A. 9. 6. 1 铝含量以X计，计算按式（A.9）计算：

ND×V W

………………………（A.9）

X——铝含量（mg/kg）； N——仪器读数（mg/L）； D——稀释倍数；

V——样品体积（L）； W——样品质量（kg）。

A. 9. 6. 2 铝回收率以R计，数值以%表示，计算按式（A.10）计算：

S₁- S₂

R% = ×100 （A.10）

A

其中

V

A= ×C

W

式中：

R——回收率，（%）； S₁——加标样品结果； S₂——样品结果；

A——加标物的含量，（mg/kg）； V——加标物的体积，（mL）； W——样品的质量，（kg）； C——加标物的浓度，（mg/mL）。