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免疫刺激抗体偶联物（ISAC）将肿瘤靶向单克隆抗体与免疫刺激剂结合起来，将免疫激活剂靶向递送到肿瘤微环境中，激活免疫系统对抗肿瘤。

NJH395是一种新型的免疫刺激抗体偶联物（ISAC），由诺华公司开发，用于治疗非乳腺癌HER2+晚期恶性肿瘤。这种药物结合了HER2抗体和TLR7激动剂。抗HER2单克隆抗体（曲妥珠单抗的半胱氨酸工程变体，MIW338）与TLR7激动剂共价连接组成的ISAC。NJH395在肿瘤细胞表面与HER2结合，进而内吞释放毒素。TLR7的激活诱导了I型IFN反应，引起肿瘤微环境中免疫反应，主要表现为髓系细胞增殖和T细胞活，促进肿瘤特异性免疫记忆和抗肿瘤反应。

 图：抗HER2-TLR7 ISAC NJH395的作用机制。

MIW338是一种结合HER2的人源化单克隆抗体，属于IgG1/κ同种型亚类，与曲妥珠单抗（Trastuzumab）序列相似。在MIW338中引入四个半胱氨酸残基，不会影响与HER2和FcγR结合；通过马来酰亚胺与TLR7激动剂进行位点特异性偶联，采用非可裂解Linker来提供稳定性，最大程度地减少免疫毒性。

利用NJH395及MIW338处理HER2+乳腺癌细胞HCC1954，实验数据表明，二者可与靶细胞结合，同型对照不会；可检测到NJH395在HCC1954细胞中的内化作用，但NJH397(同种型对照ISAC )未见内化。NJH395与N87胃癌细胞的体外孵育可打开马来酰亚胺环，表明NJH395在内化后被溶酶体加工产生活性分解代谢物，主要由MIM697 (Cys-Linker-Payload)和次要分解代谢物YFB712组成。利用这些分解代谢物在体外测定TLR激活效果，MIM697，YFB712在HEK293-TLR7细胞系中评估了NF-kB报告基因下游的荧光素酶的活性。此外，MIM697呈现出TLR7特异性，其在HEK-TLR8报告基因测定中没有表现出显著活性。

MIM697和YFB712诱导IFNα 和IL6分泌，表明人PBMC中TLR7的强烈激活。NJH395或MIW338全血检测，qPCR结果显示NJH395处理组的TNFα、IL6和IL1β基因上调，MIW338处理组没有上调，TLR7下游信号通路中的OAS1和OAS2上调，表明这些上调是由TLR7激动作用所致。

通过HER2+ HCC1954细胞和HER2- THP-1巨噬细胞的共培养进一步评估NJH395的药效活性，NJH395或对照共孵育后评估上清液的IL1β分泌。与NJH397相比，当表达TLR7+ THP-1巨噬细胞和HER2+ HCC1954共培养时，NJH395诱导更多的IL1β分泌，MIW338和同型对照人IgG1处理组未检测到IL1β，NJH395单独与HCC1954肿瘤细胞孵育后不会诱导IL1β。 此外，MIM697诱导了THP-1巨噬细胞NF-kB的磷酸化。

NJH395的体内活性检测。在N87和HCC1954肿瘤中，NJH395剂量≥3 mg/kg完全缓解。MIW338或NJH397没有观察到显著抗肿瘤作用，这表明HER2靶向和TLR7激动作用有助于NJH395体内功效的发挥。与对照相比，NJH395在三种模型中均能显著抑制肿瘤生长。

临床前异种移植研究。在携带N87肿瘤的SCID小鼠中，单剂量静脉注射NJH395与每周两次腹膜内注射氯膦酸盐脂质体同时进行，并与对照组（未经治疗或用单一给药）进行比较。单独用NJH395治疗的小鼠在第28天的肿瘤明显更小，单独使用一或两剂氯膦酸盐脂质体后，Iba-1+巨噬细胞的肿瘤浸润减少；但在NJH395治疗后，即使联合氯膦酸脂质体也增加。

NJH395毒理学研究。在食蟹猴中进行单剂量和重复剂量。经NJH395治疗的食蟹猴细胞因子增加，NJH395、NJH397和MIM697诱导高细胞因子表达，与人全血中的TLR7激动作用一致。临床前PK数据表明，NJH395总ISAC（抗HER2抗体结合至少一种TLR7激动剂）和总抗体（抗HER2抗体结合或不含TLR7激动剂）的PK谱具有可比性。当单次静脉推注剂量为30mg/kg时1只猴出现神经炎症。NJH395会产生ADA（抗药抗体）。

NJH395于2018年12月进行I期临床试验(NCT03696771)，用于非乳腺HER2+恶性肿瘤的治疗。来自单次剂量递增的18名患者的数据表明，TLR7激动剂在HER2+肿瘤细胞中诱导I型IFN反应，这与肿瘤微环境中的免疫调节相关，但其在耐受剂量下疗效不足，客观缓解率(ORR)为0%。NJH395诱导快速而强大的全身免疫激活，细胞因子释放综合征(55.6%, Gr≥2)是常见的药物相关不良表现。高剂量给药会产生ADA和神经炎症，作为第一个在人体中测试ISAC的临床试验，其结果不如人意。

除TLR受体激动剂构建的ISAC外，Sting激动剂构建的ISAC也前途坎坷。2023年3月13日，Mersana宣布其ISAC管线XMT-2056的Ⅰ期临床试验(NCT05514717)被FDA叫停。由Bolt Biotherapeutics开发BDC-1001于2023年9月22日获得孤儿药资格(Orphan Drug Designation)，其由Trastuzumab生物类似物与TLR7/8激动剂通过不可裂解连接子(聚乙二醇链)偶联，但是，于2024年5月14日停止开发。

针对ISAC疗效改善的可行性策略，可以考虑以下几点：
1、优化免疫刺激剂的选择：选择合适的免疫激动剂是ISAC研究和开发的主要挑战之一。可以通过筛选具有更好疗效和安全性的激动剂来提高ISAC的抗肿瘤功效。
2、调整药物抗体比（DAR）：药物抗体比是影响ISAC疗效和毒性的重要因素。通过调整DAR值，可以改善ISAC的药代动力学特性和减少副作用。
3、改进连接子设计：连接子的设计对于ISAC的稳定性和有效载荷的释放至关重要。开发新的连接子技术，如可切割或pH敏感的连接子，可能有助于在肿瘤微环境中更有效地释放免疫刺激剂。
4、选择低免疫原性的抗体：选择免疫原性较低的单克隆抗体可以减少抗药物抗体的产生，从而提高ISAC的疗效和安全性。
5、瘤内给药：考虑瘤内注射ISAC，以减少激动剂的全身渗漏，最大限度地减少脱靶毒性。然而，这种给药方式面临着技术挑战，包括肿瘤的可及性和注射的均匀性。
6、联合治疗策略：将ISAC与其他免疫疗法（如免疫检查点抑制剂）或传统化疗、放疗等方法联合使用，可能有助于提高治疗效果。
7、精准医疗：通过生物标志物的检测，筛选出最有可能响应ISAC治疗的患者群体，从而提高治疗的精准性和效果。
8、结构优化：通过对ISAC结构的进一步优化，例如使用双特异性抗体或改进有效载荷的化学结构，可能提高其在肿瘤微环境中的活性和选择性。

ISAC的开发仍处于早期阶段，尽管面临挑战，但通过不断的研究和创新，ISAC有望成为一种有效的癌症免疫疗法

附：文章中提及的NF-kB的磷酸化检测方法：使用Thunder技术进行检测（KIT-NFKBP-100）。用MIM697处理1h，检测THP-1细胞内的磷酸化NF-kB。使用TC处理的96孔板培养THP-1细胞，200ml培养基中加入125ng/mL PMA，37℃，5%二氧化碳孵育48h，生成贴壁细胞。去除培养基，用200 mL不含PMA的培养基替换，37℃，5%二氧化碳下静置24小时。去除培养基，在细胞中加入50 mL的培养基。MIM697用培养基连续稀释，在试验孔中加入50 mL。在37℃，5%二氧化碳下孵育1h。按照贴壁细胞二板检测方案进行检测。裂解液转移到384孔板，与检测抗体在4℃下孵育过夜后进行检测。
 

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