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Tubulin是构成微管网络的重要蛋白，可分为α、β、γ、δ、ε等多种类型，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。大家最熟悉的β-Tubulin常用在WB实验中作为内参，然而微管蛋白在有丝分裂、细胞信号转导和细胞器运输等多种细胞功能中发挥着重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。今天小优就和大家一起聊聊微管蛋白Tubulin的那些事儿。
 

01微管蛋白与肿瘤治疗
由于恶性肿瘤细胞有着快速增殖能力，有丝分裂和微管功能都十分旺盛，使得微管成为有潜力的抗肿瘤靶点之一。但靶向微管药物的长期应用会导致肿瘤产生耐药性，进而使其临床疗效逐渐减弱甚至失效。Katanin是一种微管剪切蛋白，可通过水解ATP剪切微管、使微管解聚。因此，同时作用于微管蛋白（Tubulin）和微管剪切蛋白（Katanin）的双靶点化合物可能产生更强的微管动力学扰乱和抗肿瘤作用，这种独特的作用机制有望克服当前微管靶向类药物所面临的耐药性问题。
2024年7月12日，复旦大学王洋教授课题组在《Journal of Medicinal Chemistry》报道了一系列新型二芳基取代稠杂环类化合物，这类化合物具有强效抗肿瘤和抗多药耐药作用。它们靶向Katanin/Tubulin，其作用机制已被阐明，如化合物21b会破坏肿瘤细胞中的微管网络，导致G2/M细胞周期停滞和诱导细胞凋亡。
 

既然微管蛋白tubulin潜力如此巨大，我们又该如何去研究呢？有哪些研究工具呢？

02微管蛋白研究工具
高纯度的Tubulin和Tubulin结合蛋白(MAPs)以及马达蛋白(Motors)
脑组织的微管蛋白（纯度大99%）（T240-A），可用于微管结合研究和微管聚合分析。来自癌症细胞的微管蛋白，可适用于药物筛选；荧光标记的高纯度tubulin蛋白，可用于监测活细胞中的微管动力学，此外，我们还提供来自植物或真菌来源的微管蛋白。

Tubulin (porcine brain, >99% pure) T240-A
抗微管蛋白配体的IC50和EC50测定
微管结合研究
微管蛋白单体结合研究
HDAC6研究
微管激活驱动蛋白ATPase测定

Tubulin (HTS format, porcine, 8 assays) HTS03-A
微管蛋白配体药物初步筛选中T240的经济替代品 
高通量微管蛋白聚合或解聚筛选
生产用于HTS运动分析的微管底物

Tubulin MAP-rich (porcine brain)  ML116-A
研究MAP对微管动力学的影响
研究MAP和微管蛋白之间的结合位点
研究抗微管药物对微管聚合的影响

Tubulin (HiLyte 488TM dye labeled; porcine, micro-injctn)  TL488M-B
Tubulin (Rhodamine labeled; porcine, micro-injctn)  TL590M-A
基于激光的应用
监测活细胞中的微管动态
斑点显微镜
荧光微管的形成
MAP和微管相关运动活动的显微镜研究
纳米技术

微管结合蛋白  ( Microtubule Associated Proteins，MAP)  是与微管或微管蛋白可以相互作用的蛋白质。通过与微管的相互作用，MAP蛋白执行一系列功能，包括微管的动态控制、沿微管运输、协助细胞运动和塑性，以及一系列其他的功能。如常见的MAP1、MAP2和Tau蛋白在中枢神经系统组织中表达，且有助于稳定微管的结构。马达蛋白（Motor）也可以被分类为MAP蛋白，通常也被称为驱动蛋白（Kinesin）或动力蛋白（Dynein）。
CENP-E Motor domain (Hm.sap.) CP01-A
Eg5 Motor Domain (Hm.sap.)  EG01-A
KIFC3 Motor Domain (Hm.sap)  KC01-A
MKLP1 Motor Domain  MP01-XL
微管活化ATPase活性的测量
识别/表征影响运动 ATPase活性的蛋白质或小分子
影响驱动蛋白运动的蛋白质或小分子的鉴定/表征
识别/表征影响马达/微管相互作用的蛋白质或小分子

Tau (bovine brain)  TA01-B
微管结合蛋白研究的阳性对照
研究Tau对微管动力学的影响

MAP Fraction MAPF-A
微管结合蛋白研究的阳性对照
研究MAP对微管动力学的影响
许多蛋白激酶的底物

Tubulin染色探针
通过不同的探针和试剂和可以标记微管蛋白，进而研究微管动力学。常用的Tubulin染色探针有SiR, SiR700和SPY™等，成像既明亮又稳定。SiR-tubulin可穿透细胞，对微管具有高度特异性。Sir-tubulin 也可染色内源性微管，无需进行基因操作或过度表达，可用于活细胞和组织中的宽场、共聚焦、SIM或STED成像。
 

图1：人类原代真皮成纤维细胞中用SiR-Tubulin标记微管蛋白。

Tubulin聚合检测试剂盒
微管的聚合、解聚状态的失衡与恶性肿瘤细胞的增殖息息相关。与微管蛋白相互作用的化合物或蛋白质通常会改变聚合的一个或多个特征阶段：成核期，生长期，和稳态期，可以用微管蛋白聚合检测试剂盒检测上述特征阶段。目前常见的微管蛋白聚合检测试剂盒有两种：
（1）基于吸光度（光散射）的经典型分析方法（OD-based）：基于光散射原理，激发光透过微管会发生散射，其散射程度与微管聚合物的浓度在一定范围内成正比。

主要应用：
筛查化合物对微管蛋白聚合活性的影响
筛查蛋白质对微管蛋白聚合活性的影响
利用微管蛋白进行HTS 

应用示例：检测微管蛋白配体对微管蛋白聚合的影响
 

图2：单独的标准聚合反应（G-PEM加5%甘油标准测定对照）以及在5µM paclitaxel、0.5μM paclitaxel和5µM nocodazole存在下的聚合反应。在有5µM paclitaxel存在的情况下，Vmax值提高了4倍，而在有nocodazole存在的情况下，Vmax值降低了2.2倍。

（2）基于荧光分析（DAPI荧光基团）的新型聚合分析方法（Fluorescence-based）：因为聚合发生时荧光报告基因会被掺入微管中，所以聚合后荧光增强。相较于吸光度测定的方法，荧光分析的检测方法具有高灵敏度、高效、高通量且性价比高等优点。

主要应用：
高通量抗癌化合物筛选
测量化合物IC50和微管蛋白特异性的基础研究
筛选对微管蛋白聚合活性有影响的蛋白质

应用示例：检测紫杉醇或长春新碱是否存在对微管蛋白聚合的影响
 

图3：在标准聚合反应中加入抗有丝分裂聚合增强剂紫杉醇（Paclitaxel）后，可以提高生长阶段的Vmax值，而3μM微管抑制药物长春碱（Vinblastine）引起V-max的急剧下降和最终聚合物质量的降低。

表1：两种微管蛋白聚合检测方法的比较
 

微管/微管蛋白含量测定试剂盒
细胞或组织在一种能够稳定微管结构的裂解缓冲液中进行裂解，这种裂解条件可以保持细胞内微管与微管蛋白比例的真实情况。裂解后，通过离心将聚合的微管（沉淀部分）与非聚合的微管蛋白（上清部分）分离。之后，分别对上清液和沉淀物中的微管/微管蛋白进行Western印迹分析。最终可以得到结合到细胞骨架上的微管蛋白量与存在于细胞质中的游离微管蛋白量之间的比例。

主要应用：
研究化合物对细胞中微管蛋白与微管比例的影响
研究突变细胞系与其亲本细胞系相比，两者微管蛋白与微管比例的变化
研究环境的物理变化对细胞中微管蛋白与微管比例的影响

应用案例：经紫杉醇处理与未经紫杉醇处理的3T3细胞中的微管/微管蛋白分布对比
 

图4：未经紫杉醇处理和经过紫杉醇处理的3T3细胞，其低速（LS）和超速离心（HS）样本的Western印迹分析。将未经处理或者用1μM紫杉醇处理过1小时的3T3细胞裂解物进行低速（1000g）离心，低速离心得到的沉淀物（LSP）保存用于后续的Western分析。然后将低速离心的上清液再以100,000g进行超速离心，并且保留上清液（HSS）和沉淀物（HSP），用于Western分析。结果表明：大部分经紫杉醇稳定的微管出现在低速颗粒（LSP/紫杉醇处理）中，而未处理样品中的大部分微管出现在高速超颗粒中。这种微管、微管蛋白处在不同的上清或沉淀物中的结果，意味着紫杉醇能够促进微管的聚合，从而导致更多的微管蛋白在低速离心过程中沉淀下来，而非停留在上清中。

微管结合测定试剂盒
基于微管在高离心力（100,000 x g）作用下沉降的原理，因此，任何与微管相关的蛋白质在离心时也会随之沉降。通过简单的SDS-PAGE分析上清液和沉降物，可以确定蛋白质是否能与微管结合。

主要应用：
确定蛋白质或化合物是否与微管结合
测试各种缺失突变体结合微管的能力，然后计算它们对微管的亲和力，从而确定微管结合位点
从细胞中提取驱动蛋白的类似物或进行突变后，测试它们对微管的亲和力

应用案例：检测MAP蛋白是否与微管结合
 

图5：使用BK029进行MAP结合测定分析。将微管与缓冲液 (MT)、MAP蛋白(MT+MAPF)或BSA (MT+BSA) 混合，然后以100,000xg的速度离心使微管 沉淀。通过SDS-PAGE检查上清液(S)和沉淀(P)级分。结果显示：MAP蛋白与MT（MT+MAPF）结合并共沉淀。单独的MAP(MAPF)或BSA (BSA) 蛋白不会沉淀。

Tubulin检测抗体
可检测α、β、γ等多种Tubulin亚型，包括人、大鼠、小鼠和酵母菌真菌等多种样本。

注：WB：蛋白免疫印记；IF：免疫荧光；ICC：细胞免疫荧光；IHC：免疫组织化学；FCM：流式细胞术；ELISA：酶联免疫吸附试验

Tubulin相关工具化合物
Tubulin相关的抑制剂、激动剂等，用于体内或体外研究。

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