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前言：

肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniformis）是一种固着性、根内半寄生线虫，常发生于热带和亚热带地区。该线虫具有生活史短、繁殖速度快以及对不同土壤类型适应性强的特点，每cm³土壤存在1~2个雌虫便可引起显著减产。在美国某些地区的危害已经超过根结线虫，成为制约当地棉花和大豆生产的主要线虫病原物。

从单个线虫中扩增DNA用于进一步的分子分析有时是具有挑战性的。在这项研究中，需要评估两种全基因组扩增(WGA)方法在单个肾形线虫DNA扩增中的效率，使用REPLI-g Mini和Midi试剂盒以及GenomePlex单细胞全基因组扩增试剂盒进行WGA。

 

方法：

番茄植物的根部提取肾形线虫的卵，经过各种高温消毒灭菌在室温下保存2-4天，使卵孵化，从十四个单一灭菌的雌性肾形线虫中提取DNA，扩增18s rRNA的基因，为了证实不被细菌污染扩增16S rDNA区域即可，使用TOPO TA克隆将来自七个雌性线虫个体的PCR产物克隆到质粒载体中，对来自每种线虫的至少10个菌落的质粒插入片段进行双向测序。然后使用NCBI网站上的标准核苷酸-核苷酸BLAST (blastn)筛选该序列与肾形线虫序列的同源性，鉴定与GenBank中肾形线虫序列具有高度同源性的线虫序列，并按照研究的方案将这些线虫的DNA用于全基因组扩增(WGA)。在确认不存在细菌污染后，将四种雌性肾形线虫的DNA用于WGA。使用REPLI-g Mini和Midi以及GenomePlex单细胞全基因组扩增进行WGA，测定扩增子的浓度。使用18S和细菌引物进一步扩增从两种WGA方法获得的PCR产物。

使用16S rRNA基因特异性引物用实时PCR来验证从WGA扩增获得的结果，以检查任何细菌污染。对全基因组扩增的DNA进行定量。纯化的gDNA文库(10μg/μl)在454个高通量测序中使用了从选定的四个单个雌性肾形线虫收集的DNA。肾形线虫基因组序列的基因本体(GO)分布使用Blast2GO(http://www.blast2go.com)功能注释和可视化工具进行分析

 

结果：

1.使用18S rRNA引物进行扩增，对所有14种雌性肾形线虫产生了600bp的条带（图1）。阳性对照（假单胞菌DNA）扩增出200bp的条带；然而，包括阴性对照（无DNA酶的水）在内的所有肾形线虫样品均未显示扩增（图2）。

 

 

图1

图2

 

2.使用REPLI-g和SIGMA试剂盒对四种选定的雌性线虫进行全基因组扩增（WGA），显示出不同的扩增（图3和图4）。

 

图3： 使用REPLI-g-Mini和Midi试剂盒对4种雌性肾形线虫进行全基因组扩增（WGA）。

 

图4 ：使用SIGMA试剂盒对4种雌性肾形线虫进行全基因组扩增（WGA）。

 

3.从肾形线虫构建了由REPLI-g和SIGMA基因组文库产生的总共4Mb和12Mb的序列数据。为了减少数据冗余，使用Lasergene软件对序列进行组装以提高质量和长度，分别为REPLI-g和SIGMA文库生成28784和24508个重叠群。

 

表1：REPLI-g和SIGMA基因组文库的肾形线虫组装特性。

 

表2和表3：使用REPLI-g文库/SIGMA基因组文库总结肾形线虫基因组内的重复序列。

 

 

图5：肾形线虫基因组序列的基因本体论（GO）分布，由Blast2GO确定，并按SIGMA文库的分子功能分组。

 

图6：肾形线虫基因组序列的基因本体(GO)分布由Blast2GO确定，并根据REPLI-g文库的分子功能分组

 

以上数据揭示了使用两种WGA方法扩增肾形线虫个体gDNA的能力，这两种技术都有助于提高DNA浓度和鉴定重复序列，也可应用于其他种类的线虫。两个文库中重复次数最多的是低复杂性；然而，REPLI-g和SIGMA文库的最低重复序列分别是卫星和RTE/BOV-B重复序列。

 

文献好物：

QIAGEN的REPLI-g单细胞全基因组扩增系列试剂盒

 

产品特点：

●基于MDA（多重置换扩增）技术，支持从单细胞或微量DNA进行全面均一的全基因组扩增

●该技术无需任何PCR扩增，极大降低了PCR bias及duplication，同时也最大程度减少了GC偏好性，确保了扩增产物的多样性和更全面的覆盖度。

●简单的3步方案从开始到结束只需要2小时20分钟即可获得高达25–35g DNA的稳定产量

●包括低温保护试剂，以最大限度地减少单细胞采集、储存或运输过程中的DNA损伤

●扩增产物后续可用于NGS、三代测序、芯片、PCR等多种分析方案。

 

下图由用扩增产物进行二代测序，获得高品质结果。这表明该试剂盒的位点覆盖率大，错配率低，其扩增的DNA（甚至从单一细菌细胞中扩增的DNA）能够与纯化获得的基因组DNA相媲美。

 

REPLI-g单细胞其他系列扩增试剂盒

 

另QIANGEN也提供二代测序的单细胞建库试剂盒

 

产品特点：

●单细胞全基因组文库构建不到4小时，包含实验所需的所有试剂

●包括独特的双端接头(UDI ),以最大限度地减少因Illumina NGS仪器上的标签跳跃问题

●为后续测试提供无PCR的NGS文库和扩增的gDNA

●REPLI-g DNA聚合酶MDA提供高保真扩增并减少假阳性

●分析基因组中任何地方的序列和拷贝数变异

 

 

REPLI-g系列试剂盒在更多文献中的应用

1.Single-cell analysis of somatic mutations in human bronchial epithelial cells in relation to aging and smoking

https://www.nature.com/articles/s41588-022-01035-w

杂志：Nature Genetics

肺癌是全球死亡数最高的癌症，吸烟被认为会加剧肺癌的患病风险，为验证研究人员获取了吸烟不同对象的近端支气管基底细胞，并进行了单细胞维度（REPLI-g）的全基因组体细胞突变谱分析,表明随年龄的增长，体细胞突变的数量会逐渐增加，包括SNV和InDel。而吸烟者中，这些突变的数量则会显著更高，也说明了吸烟确实会通过增加DNA突变来增加肺癌风险,在进一步分析发现不断增加的突变率最终会趋于平稳，呈直线上升的突变率在“23包年”之后却开始出现保持不变的情况。就是说这些大量吸烟者的细胞中可能出现了某种机制，抑制了进一步的DNA突变的积累，可能这些人具有更强大的DNA损伤修复系统，可以对吸烟带来的DNA突变进行更强的修复。

 

2.A pipeline for copy number profiling of single circulating tumour cells to assess intrapatient tumour heterogeneity

https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1878-0261.13174

杂志：Molecular Oncology

荷兰伊拉斯谟医学院癌症研究所的科学家分离了乳腺癌和前列腺癌患者血液中的循环肿瘤细胞（CTCs）比较REPLI-g 和 Ampli1™全基因组扩增方法，进行了低通量文库制备，并进行了详细的患者CNV分析，评估患者内部的异质性。

 

3.Molecular identification of Cryptococcus gattii from cerebrospinal fluid using single-cell sequencing: A case study

https://www.journalofinfection.com/retrieve/pii/S0163445320304217

杂志：Elsevier

由于脑脊液样本提取的核酸量较低，北京放射医学研究所的研究人员先对微量核酸（REPLI-g）进行了扩增，随后通过测序鉴定出了患者感染的是隐球菌，并及时进行了对症治疗，这是在常规检测未能确定疾病原因后，首次使用单细胞测序检测和鉴定真菌病原体。报告表明，单细胞测序（scS）方法可用于直接从CM患者的CSF中产生真菌基因组序列。scS技术可能成为精确检测临床样品中显微镜可见但未培养的病原体的有力工具。

 

4.Microbial Diversity and Function in Shallow Subsurface Sediment and Oceanic Lithosphere of the Atlantis Massif

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34340550/

杂志：AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY

美国Bigelow海洋科研实验室的科学家对大西洋海底岩石层中的微生物进行了收集和单细胞（REPLI-g）测序以及扩增子、宏基因组研究，揭示了一个海洋核心复合体的浅层地下有一个生物圈，它不是由活跃的蛇纹石化反应和副产品提供燃料的。

 

5.Single gametophyte sequencing reveals that crossover events differ between sexes in maize

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6377631/

杂志：Nature Communications

该文章发表了一种分离玉米单雌配子体运用REPLI-g单细胞方案，进行雌性配子体的裂解和全基因组的扩增(MDA)，进行基因组测序的方法，这项研究为理解两性间CO产生的分子机制提供了见解，并可能有助于通过父系选择提高玉米育种效率。

 

6.Cholinergic neurons in the dorsomedial hypothalamus regulate mouse brown adipose tissue metabolism

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26042202/

杂志：Elsevier

脑切片单细胞样本运用REPLI-g WTA单细胞试剂盒进行qRT-PCR分析，对Rpa中逆向鉴定的BAT投射神经元的单细胞qRT-PCR分析显示，所有表达M2受体的神经元都含有色氨酸羟化酶2。在DMH中缺乏Chat基因的动物中，暴露于温暖的温度既不会降低BAT-Ucp1也不会降低Pgc1αmRNA的表达。

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