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荧光标记抗体的蛋白质印迹法

        对于蛋白质印迹，将膜与稀释在含有5% w/v BSA或脱脂奶粉的1×TBST（0.1% Tween®20）中的一抗在振荡器上于4°C下孵育过夜。请参阅一抗产品网页了解推荐的一抗稀释缓冲液和抗体稀释度。

        双色蛋白质印迹需要来自不同物种的一抗和用不同染料标记的二抗。表位重叠可能会造成干扰，在双色蛋白质印迹中应予以考虑。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，则在两种缓冲液中测试每种一抗，以确定最适合双标记实验的缓冲液。

所需溶液和试剂

        - 20×磷酸盐缓冲液（PBS）1 L：将50 ml 20×PBS 加入 950 ml dH2O 中并混合。

        - 10×Tris缓冲盐水（TBS）1 L：将100 ml 10×TBS 加入900 ml dH2O 中并混合。

        - 1×SDS上样缓冲液：蓝色上样包或红色上样包；将1/10体积的30×二硫苏糖醇（DTT）加入1 体积的3×SDS上样缓冲液中，配制新鲜的3×还原性上样缓冲液。用dH2O稀释至1×。

        - 10×Tris-Glycine SDS电泳缓冲液1 L：将100 ml 10×电泳缓冲液加入900 ml dH2O中并混合。

        - 10×Tris-Glycine转移缓冲液1 L：将100 ml 10×转移缓冲液添加到200 ml甲醇+ 700 ml dH2O中并混合。

        -10×Tris缓冲盐水（含Tween®20）（TBST-10×）1 L：将100 ml 10×TBST 加入900 ml dH2O 中并混合。

        - 脱脂奶粉。

        - 封闭缓冲液：1×TBS加5% w/v 脱脂奶粉；若要制备150 ml，则将7.5 g脱脂奶粉加入150 ml 1×TBS 中并充分混合。不应将Tween® 20 添加到封闭缓冲液中，因为它具有自发荧光，并且会增加非特异性背景。封闭步骤后，将Tween®20添加到后续稀释缓冲液中。

        - 洗涤缓冲液：1×TBST。

        - 牛血清白蛋白（BSA），如B265993。

        - 一抗稀释缓冲液：1×TBST，含 5% BSA或5%脱脂奶粉，如一抗数据表所示；若要配制20 ml，则将1.0 g BSA或脱脂奶粉加入20 ml 1×TBST 中并混匀。

        - 二抗稀释缓冲液：1×TBST加5%脱脂奶粉；将1.0 g脱脂奶粉加入20 ml 1×TBST中并充分混合。（二抗；抗兔Ab181958 和 Ab176447；抗鼠 Ab181952 和 Ab179006）。

        - 预染蛋白质标准，范围广（10 - 180 kDa），例如M665706。

        - 对于印迹膜和纸，通常建议孔径为0.2 µm。

        注意：建议使用反渗透去离子（RODI）水或同等级别的水来配制溶液。

实验步骤

1. 样品制备

1）从培养物中吸出培养基并用预冷的1×PBS清洗细胞。

2）除去 PBS，加入 1×SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl或10 cm 直径板每板 500 µl）以裂解细胞。立即从板上刮下细胞，将提取物转移到微量离心管中，放在冰上。

3）超声波处理10 - 15秒。

4）取每个样品20 µl，在95 - 100 ℃下加热5分钟，然后在冰上冷却。

        注意：具体上样量可根据蛋白浓度及实验要求进行调整，为避免蒸发、粘壁等造成体积损失，需制备适量样品。

5）放入微量离心机离心5分钟。

2. 上样及电泳

1）组装预先配置好的SDS-PAGE凝胶（10 cm×10 cm），并加入电泳缓冲液。

2）将20 µl上样到SDS-PAGE凝胶（10 cm×10 cm）上。

        注意：具体上样量可根据蛋白浓度和实验要求进行调整。

        建议加入预染蛋白分子量标准品（M665706，10 µl/lane）来验证蛋白转移并测定分子量。

3）根据蛋白质的分子量设置电压和电泳时间，开始跑胶。

3. 转膜

        按正确的顺序组装凝胶和转印装置，设定电压和转印时间，转移到硝酸纤维素膜上。有关详细的转移程序，请参阅《蛋白质印迹的通用实验方案》。

4. 膜阻断和抗体孵育

        注：容量适用于10 cm×10 cm（100 cm2）的膜；对于不同尺寸的膜，容量相应调整。

1）（可选）转移后，室温下用25 ml TBS清洗硝酸纤维素膜5分钟。

2）将膜放入25 ml封闭缓冲液中，室温下孵育1小时。

        注意：请勿将 Tween®20添加到封闭缓冲液中。

3）用15 ml TBST洗涤三次，每次5分钟。

4）取10 ml封闭缓冲液加入一抗（按产品说明书建议稀释度），配制一抗稀释液，将膜放入一抗稀释缓冲液中，在振荡器上4°C孵育过夜。

5）用15 ml TBST洗涤三次，每次5分钟。

6）将膜放入 10 ml荧光素偶联的二抗稀释液（如Ab181958、 Ab176447、 Ab181952 和 Ab179006）（1 mg/ml 原液，稀释度为 1:5000-1:25,000）中，并在振荡器上室温孵育1小时。

7）用15 ml TBST洗涤三次，每次5分钟。

5. 蛋白质检测

1）沥干膜上多余的TBST，并使其干燥。

        注意：对于荧光染色，确保膜干燥非常重要。

2）使用合适的荧光扫描仪并按照制造商的建议扫描膜。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

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