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固定免疫沉淀实验方案

        免疫沉淀实验是生物化学和分子生物学中用于研究蛋白质相互作用和蛋白质表达状态的重要技术。根据实验的具体需求和条件，可以采用不同的免疫沉淀方法，主要包括磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。

        磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合，进而捕获目标蛋白。这种方法的特点在于操作简便、快速，且分离效率高，特别适合高通量筛选和自动化实验。磁珠通过磁性分离架进行快速分离，使得实验步骤更加简洁。此外，磁珠免疫沉淀法在研究蛋白质-蛋白质相互作用和信号传导途径时尤为有用。

        固定免疫沉淀法则使用固定化的抗体（通常是抗体偶联到珠子上）捕获目标蛋白，通常用于蛋白质印迹法（Western Blot）分析前的样品准备。这种方法需要更长的孵育时间来形成免疫复合物，但能提供高特异性和灵敏度的结果，适合于定量分析目标蛋白的表达和修饰状态。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰或蛋白质稳定性时尤为重要。

        之前介绍过磁珠免疫沉淀法的具体操作，本文将针对固定免疫沉淀法的实验操作进行具体描述。

所需溶液与试剂

（1）PBS缓冲液。

（2）1× 细胞裂解缓冲液：20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml亮抑酶肽。

（3）3× SDS样品缓冲液：187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30%甘油，150 mM DTT，0.03% w/v溴酚蓝。

        注：以上溶液均用超纯水制备。

        细胞裂解液在使用前添加1 mM PMSF。

1.制备细胞裂解物

1.1吸干培养基。根据实验目的，添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞处理一段时间。

1.2去除培养基，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次。

1.3去除PBS，每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml预冷的1× 细胞裂解缓冲液和1 mM PMSF。

1.4置于冰上孵育5分钟。

1.5从板上轻轻刮下细胞，转移至微量离心管，置于冰上。

1.6在冰上对样品超声处理四次，每次5秒。

1.7在4°C下微量离心10分钟，然后将上清液转移到一根新的试管中。

1.8尽快进入下一步，如暂时不进行后续实验，需将裂解物保存在-80°C。

2.免疫沉淀法

2.1取200 μl细胞裂解物，并添加10 µl固定抗体，置于摇床上轻轻摇动，在4°C下孵育过夜。

2.2于4°C条件下微量离心30秒。

2.3用500 µl的1×细胞裂解缓冲液，重悬沉淀物进行清洗，然后离心去除上清，共清洗五次。洗涤间期，保持样品于冰上。

2.4使用20 μl 3× SDS样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心30秒。

2.5加热样品到95-100°C，并持续2-5分钟。

2.6取15-30 µl样品上样到SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质印迹实验（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

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