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发布人：上海泽叶生物科技有限公司
发布日期:2026/9/10 15:43:52
BCA法｜实验室最常用、性价比最高
核心原理：碱性环境下，蛋白可将二价铜离子还原为一价铜离子，一价铜与BCA试剂特异性结合，生成稳定的紫色复合物，在562nm波长下检测吸光度，结合BSA标准曲线即可计算蛋白绝对浓度。
✅优点
①灵敏度高，检测下限低，微量蛋白也能精准定量
②耐受常规去污剂，适配RIPA裂解液（含SDS、Triton）
③线性范围宽，高低浓度样本都适配，结果稳定
❌缺点
①受还原剂干扰极大，DTT、β-巯基乙醇会直接导致结果偏高、失效
②高浓度螯合剂会影响反应体系，造成定量偏差
🎯适用场景：细胞、组织裂解总蛋白样本，WB常规上样定量首选。
Bradford法（考马斯亮蓝法）｜快速便捷无还原剂干扰
核心原理：考马斯亮蓝G-250游离状态下为棕红色，与蛋白氨基酸残基结合后变为亮蓝色，在595nm波长下检测吸光度，换算蛋白浓度。
✅优点
①操作极简，5-10分钟即可完成，耗时最短
②不受还原剂干扰，适配含DTT、β-ME的样本
③试剂稳定，背景值低，重复性好
❌缺点
①对SDS、Triton X-100等去污剂极度敏感，含去污剂样本结果偏差大
②受蛋白氨基酸组成影响，不同蛋白定量结果存在轻微偏差
🎯适用场景：无强去污剂的蛋白溶液、纯化重组蛋白样本。
Lowry法｜经典老旧，现已少用
核心原理：基于福林-酚试剂与蛋白中酪氨酸、色氨酸残基发生显色反应，750nm波长检测定量。
✅特点：灵敏度尚可，但操作步骤繁琐、反应耗时久，糖类、去污剂、还原剂均会产生干扰，容错率极低。
🎯适用场景：目前主流实验室基本淘汰，仅部分老旧实验体系沿用。
核心原理：蛋白中的酪氨酸、色氨酸残基在280nm紫外波长下有特征吸收峰，吸光度与蛋白浓度正相关；可通过A260数值校正核酸污染干扰。
校正公式：蛋白浓度(mg/mL) ≈ 1.55×A₂₈₀ − 0.76×A₂₆₀
✅优点
①无损检测，不消耗样本，珍贵纯化蛋白可反复检测
②检测速度极快，无需显色试剂，操作零成本
❌ 缺点
①核酸污染会严重干扰结果，样本纯度低则数据不准
②无酪氨酸、色氨酸的特殊蛋白无法准确定量
③不适合细胞、组织混合裂解样本
🎯 适用场景：高纯度重组蛋白、纯化后单一蛋白样本定量。
这类方法不属于精准定量，只能用于样本间相对对比，无法得出绝对蛋白浓度，仅用于辅助验证上样均一性。
考马斯亮蓝凝胶染色
SDS-PAGE凝胶染色后，通过条带灰度深浅，粗略判断总蛋白上样量是否一致，成本低、操作简单，但灵敏度低、误差大。
银染
灵敏度远高于考马斯亮蓝染色，可检测微量蛋白，但仅能定性、半定量，无法精准计算浓度，多用于低丰度蛋白条带观察。
Western Blot灰度分析
通过软件分析WB条带灰度值，仅针对单一靶蛋白做相对定量，只能对比各组样本的蛋白表达高低，绝对不能用来测定总蛋白浓度。
区别于上述「总蛋白定量」，这类方法只检测样本中某一个特定目标蛋白，针对性极强，是功能蛋白检测的核心手段。
ELISA（酶联免疫吸附实验）
核心优势：可实现靶蛋白绝对定量，检测精度可达pg-ng级别，适合批量样本检测。
🎯适用场景：细胞上清分泌蛋白、血清蛋白、细胞因子、组织中低丰度靶蛋白定量。
Dot blot（斑点印迹）
操作快速、无需跑胶，可快速筛查靶蛋白表达量，但精度极低，仅用于粗略半定量对比，正式实验基本不采用。
多用于组学研究，实现全蛋白或靶向蛋白的定量分析，是高端科研常用手段。
Label-free非标记定量：
无需标记，通过肽段峰面积对比，实现多组样本蛋白相对定量，适合差异蛋白筛选。
TMT/iTRAQ标记定量：
可同时标记多组样本，通量更高、结果更稳定，适配多样本对比实验。
PRM/SRM靶向定量：
针对特定靶蛋白，实现高精度绝对定量，验证组学筛选结果。
常规细胞/组织RIPA裂解、WB上样 → 首选BCA
纯化蛋白、样本含还原剂、无去污剂 → 首选Bradford
高纯度珍贵重组蛋白、不想消耗样本 → 首选A280紫外定量
检测特定分泌蛋白、细胞因子、批量样本 → 首选ELISA
高通量筛选差异蛋白、机制初探 → 蛋白组质谱定量
选对适配的定量方法，把控好上样第一步，才能让后续WB、功能实验、互作实验的数据更精准、更有说服力。
END
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