ATCC细胞冻存方案

ATCC 官方标准细胞冻存方案

依据 ATCC 官网推荐冻存流程，适用于绝大多数贴壁 / 悬浮哺乳动物细胞；冻存核心原则：缓慢降温、高活力细胞、减少损伤

一、冻存试剂配制

方案 1：ATCC 经典冻存液（无血清通用配方，首选）

90% 完全培养基 + 10% DMSO（二甲基亚砜）

DMSO：细胞级无菌 DMSO

现配现用！DMSO 遇水放热，不要提前长时间混合

部分敏感细胞（原代、免疫细胞）可使用商业化无血清冻存液。

方案 2：血清加强版（难复苏细胞可选）

80% 胎牛血清 (FBS) + 20% DMSO

适合：THP-1、干细胞、难复苏悬浮细胞

⚠️成本高，常规肿瘤细胞不推荐长期使用。

注意：DMSO 具有细胞毒性，细胞悬液和冻存液混合后尽快分装冻存，不要室温放置超过 15 min。

二、冻存前细胞要求（ATCC 重点强调）

细胞状态：对数生长期，汇合度 70%～85%

❌不要长满、不要衰老、不要大量漂浮死细胞；

无污染：支原体、细菌、真菌阴性；

传代间隔：冻存最好在复苏后 3–5 代内，避免长期连续传代；

细胞密度参考

最终冻存管浓度：1×10⁶ ~ 5×10⁶ cells / mL，每支管分装 1 mL。

悬浮细胞可以适当提高至 5×10⁶~1×10⁷ cells/mL。

三、完整操作步骤

贴壁细胞

弃培养基，PBS 清洗细胞单层；

加入胰酶消化，显微镜观察细胞回缩；

加入完全培养基中和胰酶，吹打制成单细胞悬液；

细胞悬液离心：125–200 × g，5–10 min；

小心弃上清，不要扰动细胞沉淀；

预冷冻存液轻柔重悬细胞；

分装至无菌冻存管，每管 1 mL；

标记：细胞名称、ATCC 编号、冻存日期、代次、操作者。

悬浮细胞

无需胰酶，直接收集细胞悬液，离心，后续步骤同上。

四、降温程序【最关键步骤】

方法 A：程序降温盒（实验室最常用，ATCC 推荐）

冻存管放入装有异丙醇的降温盒；

直接置于 -80℃冰箱；

静置 16～24 h，实现约 -1℃/min 缓慢降温；

24 h 内转移至液氮气相（-135℃以下）长期保存。

❗禁止长期把细胞留在 - 80℃，多数细胞 1–3 个月活力大幅下降。

方法 B：程序降温仪（高标准、新药 / 高分论文首选）

标准降温曲线（ATCC 参考）

室温 → 4℃ 平衡 5 min

4℃ → -40℃：降温速率 -1 ℃/min

-40℃ → -90℃：降温速率 -5 ℃/min

到达 - 90℃后立即移入液氮

❌严禁操作

直接把冻存管丢进液氮！极速冷冻形成冰晶刺破细胞膜，复苏存活率极低。

五、长期储存

最优条件：液氮气相储存（Vapor Phase LN2，-130 ~ -196℃）

✅优势：避免液氮渗入冻存管，防止冻存管爆炸、交叉污染；

不要浸没液相液氮（密封不良存在安全风险）。

六、复苏配套注意（冻存的后续闭环）

ATCC 要求：冻存细胞复苏时37℃快速融化（≤2 分钟），及时离心去除 DMSO，降低毒性。

七、常见问题 & ATCC 官方提醒

DMSO 浓度能不能改动？

常规细胞固定 10%；不建议＞15%，毒性上升；

冻存液能否 4℃提前配好存放？

不建议，最好现配；商业化冻存液按产品说明书；

复苏存活率低常见原因

细胞冻存时已经老化 / 密度不对

降温速度过快

-80℃放置太久未转入液氮

DMSO 室温作用时间过长

冻存管：使用耐低温无菌冻存管，普通 EP 管不能放液氮

补充：简易 SOP 文本（你可以直接拷贝用于实验记录）

收集对数生长期细胞，离心去除培养基；

预冷冻存液（90% 完全培养基 + 10% DMSO）重悬细胞至 1–5×10⁶ cells/mL；

1 mL / 管分装冻存管，做好标识；

程序降温盒 - 80℃放置 16–24 h；

转移至液氮气相长期保存。