多菌混合体系中分离纯化单一菌株的常用操作方法有哪些？

发布人：上海抚生实业有限公司

发布日期:2026/7/27 15:15:37

结合微生物保藏、PCR物种鉴定等相关实验背景，多株混合菌体系中单独纯化单一菌株，可通过梯度稀释分离、选择性筛选、分子辅助验证的全流程方案实现，具体详细操作如下：

一、梯度稀释涂布初分离

将混合菌液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，依次得到10^-1到10^-8的系列稀释液，根据混合菌的浓度选择3个合适的低浓度梯度。

取每个梯度的稀释液涂布到对应的非选择性固体培养基上，置于适宜温度的培养箱中培养12~48小时，待单菌落充分长出，不同菌株会形成形态、颜色、大小有明显差异的独立单菌落。

二、针对性选择性筛选

根据目标菌株的生理特性，配制专属选择性培养基，比如添加特定抗生素、碳源/氮源，抑制混合体系中其他杂菌的生长，仅让目标菌株正常增殖，大幅降低分离难度。

结合目标菌株的功能特性，比如产酶、抑菌特性，在筛选平板上加入对应的显色底物，目标菌落周围会形成透明圈、显色圈，可直接快速定位目标单菌落。

三、连续纯化传代验证

挑取初筛得到的疑似目标单菌落，在新的纯化平板上连续划线传代3~5次，每次传代后观察菌落形态是否完全均一，排除仍存在少量杂菌的混合菌落。

挑取纯化后的单菌落接种到液体培养基中培养，镜检观察菌体形态是否完全一致，初步确认体系中仅存在单一菌株。

四、分子鉴定最终确认

提取纯化后菌株的基因组DNA，用16S rRNA通用引物进行PCR扩增测序，将测序结果和NCBI数据库比对，100%匹配目标菌株的序列，即可确认单一菌株纯化完成，完全排除近缘杂菌残留的可能。