【流式研习社 6】流式配色全攻略：从原理到实战，轻松设计多色Panel

流式细胞术（Flow Cytometry）作为一种强大的细胞分析工具，广泛应用于免疫学、肿瘤学、干细胞研究等领域。流式细胞术实验结果的准确性在很大程度上依赖于实验的配色方案。一个优秀的配色方案能够在最大化信号分辨率的同时，最小化荧光干扰。本文将直接围绕流式配色的核心环节：目标Marker的选择，流式细胞仪的配置，如何利用荧光素信息合理搭配目标Marker，并结合具体方案把手教你设计出信号清晰、背景干净、数据可信的多色流式方案。

一、明确目标：如何根据实验目的选择Marker

在流式细胞术中，最基本的任务是确定检测哪些细胞群体需要被检测，以及每个细胞群体的具体标志物。因此，我们需要明确以下四个问题：

要检测的细胞群体是什么？（如T细胞、B细胞、NK细胞）

哪些是目标群体的标志？（如CD45用于圈定淋巴细胞）

哪些是目标的功能性或状态标志物？（如Treg细胞需要CD25，Foxp3）

各标志物的表达水平如何？（高、中、低）

表1. 常见免疫细胞标记物

图1. 常见人类表面抗原的密度

二、熟悉仪器：了解流式细胞仪的激光与滤光片配置

在进行多色流式实验前，必须清楚流式细胞仪的配置。不同品牌和型号的滤光片设置各异，通过仪器配置的信息，确认可以选择哪些荧光素。常见激光器如表2所示。

表2. 流式细胞术中的常见激光器

三、读懂荧光：关键参数与光谱重叠分析

前面我们通过仪器配置知道了仪器可以检测哪些荧光素，然后我们就需要通过荧光素的相关参数（激发光谱、发射光谱、相对亮度等等）来确定哪些荧光素是可以在一个panel中兼容的。激发光谱与发射光谱重叠严重的不可以在一个panel中使用，尽量选择激发光谱和发射光谱重叠较小的荧光素。

更多荧光素选择信息请查看：如何看懂光谱图：流式细胞术多色panel设计的关键

表3. 常见荧光素信息

图2. 常见荧光素光谱图

四、科学搭配：抗原与荧光素的“强弱配对”原则

确定了需要检测哪些Marker，需要用到哪些荧光素，接下来就需要将荧光素与Marker搭配起来。荧光染料亮度有强弱之分，Marker表达有高低区别。流式配色的“黄金法则”就是：强弱搭配，亮度更高的荧光染料搭配低丰度Marker，亮度较低的荧光染料与高丰度Marker匹配。

图3. Human CD3- FITC与Human CD3- PE检测结果对比

图4. Mouse Foxp3- AF488与Mouse Foxp3- BV421检测结果对比

图3和图4的对比结果可以看出，高丰度Marker用选择强荧光素或者弱荧光素对结果影响不大，但是低丰度Marker用低亮度荧光素，就会导致阳性细胞群信号不明显。

表4. 不同丰度Marker与荧光素搭配建议

五、实战演练

我们以最常见的FITC、PE、APC、PerCP这四种荧光素为例，展示不同实验方案的配色。这四种荧光素光谱重叠度较小，而且可以适配市面上大部分的流式细胞仪。

1. 人外周血T/B/NK细胞检测

检测的目标是T细胞、B细胞、NK细胞，这三种细胞都是淋巴细胞，淋巴细胞Marker是CD45，T细胞Marker是CD3，B细胞是CD19，NK细胞的Marker是CD56，这四个指Marker表达量从高到底分别是：CD45＞CD3＞CD19＞CD56，根据表3的亮度信息按照强弱搭配原则配色结果如表5所示：

表5. 人外周血T/B/NK细胞检测配色表

实验结果：

图5. 人外周血裂解红细胞后检测T/B/NK细胞结果

2. 小鼠脾脏Treg细胞检测

检测的目标是小鼠脾脏Treg细胞，Treg细胞的Marker是：CD4+CD25+ Foxp3+，CD25、Foxp3属于弱表达指标，需要搭配强荧光素APC和PE， CD4可以表达量高，可以用PerCP或FITC。配色结果如表6所示：

表6. 小鼠脾脏Treg细胞检测配色表

实验结果

图6. 小鼠脾脏Treg细胞检测结果

总结

合理的配色是确保流式细胞术实验数据准确性和可靠性的关键。通过充分了解实验目的、流式细胞仪配置和荧光染料的特性，科学合理地搭配荧光染料，能够有效提升实验灵敏度和信号检测能力。