为什么I型胶原蛋白能成为细胞培养和组织工程中的黄金基质？

胶原蛋白三螺旋结构

I型胶原蛋白的结构特点是什么？

I型胶原蛋白在结构上由2个α1链和1个α2链组成的异源多聚体，在37°C中性pH条件下自发形成三股螺旋结构。这种独特的三重螺旋构象（Triple Helix）赋予了胶原蛋白高度的机械强度和生物稳定性。

分子特性：

• 自组装能力：在适宜条件下，三螺旋分子进一步组装成胶原纤维（Collagen Fibrils），形成网状支架

• 细胞黏附位点：分子中含有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）等细胞黏附序列，可被细胞膜上的整合素受体识别

• 生物降解性：可被胶原酶特异性降解，在组织工程中具有良好的生物可吸收性

胶原纤维电镜结构

鼠尾胶原与牛跟腱胶原有何区别？

根据来源和提取工艺的不同，实验室常用的I型胶原蛋白主要分为两大类：

鼠尾胶原蛋白（Rat Tail Collagen）

• 来源：通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤从大鼠尾巴肌腱制备

• 形态：溶于6mM醋酸（HAc）的无菌溶液，浓度通常为5mg/mL

• 特性：保留完整的三螺旋结构和成胶能力，可在中性pH和37°C条件下自组装形成凝胶

• 应用：既能用于培养表面包被，也能用于三维胶原凝胶制备

牛跟腱胶原蛋白（Bovine Tendon Collagen）

• 来源：从牛跟腱提取，通常为去端肽胶原（Atelocollagen），即通过酶切去除端肽区域的纯化胶原

• 形态：白色或浅黄色粉末，生物试剂级（BR级），可溶于水

• 特性：酶解较为彻底，分子量较低，不具备成胶能力，无法形成三维凝胶

• 应用：主要用于细胞表面包被、细胞黏附研究、药物筛选等二维培养体系

关键区别总结：

如何建立标准化的表面包被流程？

对于在普通塑料培养器皿表面不易贴壁的细胞（如原代肝细胞、成纤维细胞、上皮细胞等），胶原蛋白表面包被可显著提高细胞黏附率和铺展形态。

推荐包被参数：

• 浓度范围：1-5 μg/cm²，起始优化建议5 μg/cm²

• 稀释液：6mM醋酸溶液（对于鼠尾胶原储备液）

操作流程（以鼠尾胶原为例）：

1. 稀释：将5mg/mL储备液用6mM HAc稀释至工作浓度（如50μg/mL用于5μg/cm²包被）

2. 加液：按计算体积加入培养皿/板各孔，确保完全覆盖表面

• 96孔板（0.3cm²/孔）：约30μL（5μg/cm²浓度）

• 6孔板（9.5cm²/孔）：约950μL

3. 孵育：室温孵育1小时，或在超净台内开盖过夜晾干

4. 清洗：吸去多余液体，无菌PBS清洗3-4次

5. 使用：直接使用，或4-25°C保存（包被好的器皿可保存3个月）

三维胶原凝胶如何制备与使用？

三维胶原培养能够模拟体内细胞外基质的物理和生化特性，适用于研究细胞-基质相互作用、组织形态发生和药物筛选。

成胶原理：

鼠尾胶原I型在浓度>1mg/mL、pH 7.0左右时可形成具有一定强度的三维凝胶。成胶过程涉及从溶胶（Sol）到凝胶（Gel）的相变，通常在37°C条件下20分钟内完成。

制备步骤（以1mL 1mg/mL三维胶为例）：

1. 冰浴预冷：所有试剂和离心管置于冰浴中（防止提前成胶）

2. 混合：

• 取200μL胶原储备液（5mg/mL）

• 加入12μL 0.1M NaOH（中和醋酸，注意：必须将NaOH加入胶原，不可反向）

• 立即混匀

3. 稀释：加入100μL 10×PBS或10×培养液，混匀

4. 定容：加入688μL无菌水，混匀（最终pH应为7.0左右）

5. 加样：立即加到培养器皿中

6. 固化：室温（25°C）放置20分钟待胶凝固，转移到37°C培养箱

含细胞的三维胶制备：

在上述步骤3后，加入760μL细胞悬液（而非水），混匀后立即加到培养皿。细胞将均匀包裹在凝胶中，模拟体内三维生长环境。

三维胶原凝胶细胞培养

哪些细胞最适合胶原蛋白培养体系？

I型胶原蛋白作为培养基质，特别适用于以下细胞类型：

强贴壁依赖性细胞：

• 原代肝细胞：维持肝细胞极性和代谢功能，用于药物代谢研究

• 成纤维细胞：促进铺展和增殖，研究细胞外基质合成

• 上皮细胞：增强紧密连接形成，维持上皮屏障功能

• 内皮细胞：促进血管形成，用于血管生成实验

神经细胞：

• 背根神经节（DRG）神经元：促进神经突起生长

• 施万细胞：维持髓鞘形成能力

• 脊髓神经细胞：支持长期存活和分化

其他特殊细胞：

• 肌肉细胞：促进肌管形成

• 胚肺细胞：支持原代培养建立

细胞在胶原蛋白表面的黏附

使用中的关键注意事项

操作环境控制：

• 低温操作：三维胶原制备全程需在冰上进行，室温会加速成胶导致不均匀

• 无菌操作：所有步骤需在超净台内完成，避免污染影响细胞生长

pH调节关键：

• 中和顺序：必须将NaOH加入胶原溶液，不可反向，否则局部pH过高会导致胶原变性凝结

• pH检测：首次制备时建议用pH试纸检测最终混合液pH，确保在7.0左右（酚红指示剂呈粉红色）

成胶判断：

• 倾斜培养皿，凝胶应不流动

• 轻轻晃动，凝胶应具有弹性，表面无液体流动

储存与稳定性：

• 储备液：4°C保存，避免反复冻融

• 包被器皿：4-25°C可保存3个月，使用前检查无菌状态

• 三维凝胶：制备后应尽快使用，长期储存会导致凝胶脱水或蛋白降解

不同来源胶原的选择建议：

• 需要三维培养：必须使用鼠尾胶原（具有成胶能力）

• 仅需增强贴壁：可选用牛跟腱胶原（操作简便，无需中和步骤）

• 大体系包被：牛跟腱粉末更易于配制大量工作液

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