多重免疫荧光实验步骤 + 注意事项

近年来，多重免疫荧光（Multiplex Immunohistochemistry，mIHC）凭借其多标志物同步检测和空间信息分析能力，已成为肿瘤微环境研究、免疫治疗评估和空间病理学研究的重要工具。然而，与传统IHC相比，mIHC实验流程更加复杂。从抗体筛选到Panel设计，再到TSA染色和图像分析，每一个环节都可能影响最终结果。

本文将带您快速了解TSA-mIHC实验流程，并盘点实验中最常见的问题及解决思路。

目前mIHC最常使用的是FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本。组织切片厚度通常控制在4-5 μm。

烤片：之后用细毛刷轻柔地将切片从切片刀上分离，随后置于 40℃ 温水中使其充分展平，最后在 60℃ 条件下烘烤 2 h以增强切片附着力。60℃烤片1h，确保组织牢固附着于载玻片。

注意事项

✓ 使用防脱载玻片

✓ 避免组织折叠

✓ 新鲜切片优于长期保存切片

目的： 去除石蜡并逐步恢复组织水化状态，为后续抗原修复做好准备。

常见流程：二甲苯Ⅰ（10 min） → 二甲苯Ⅱ（10 min） → 无水乙醇（5 min） → 95%乙醇（5 min） → 85%乙醇（5 min） → 75%乙醇（5 min） → 蒸馏水洗涤

常见问题：组织边缘脱落

可能原因：

      • 烤片不足

      • 脱蜡时间过长

      • 载玻片附着力不足

福尔马林固定会导致蛋白交联，掩盖抗原表位，因此必须进行抗原修复。

热诱导抗原修复是最常用的方法，常见缓冲液有：柠檬酸缓冲液（pH 6.0）和EDTA缓冲液（pH 8.0-9.0）。EDTA 缓冲液可以在柠檬酸缓冲液使用效果不好时使用，但需注意在高表达样本中可能产生非特异性染色。可以多尝试几种修复方法以达到最佳染色效果。

微波修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火 8 min，停火 7 min，转小火 8 min；取出染色盒，冷却至室温。

水浴修复：加入抗原修复液，放入切片，置于水浴锅中 95℃ 恒温 25-30 min (注意控制温度避免沸腾，以防组织脱落)。将样片与水共冷，不可骤冷，避免快速降温导致抗原表位构象改变。

高压修复：在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热 5 min，关闭电源，10 min 后取出染色盒，冷却至室温。

酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解 (通常为 37°C，20 min)。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。修复后用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

注意事项

✓ 不同抗体最佳修复条件可能完全不同。

✓ 建议先完成单染验证。

采用 3% H₂O₂ 溶液室温避光孵育样本 20 min，以消除内源性过氧化物酶活性，避免其对后续 HRP 显色系统的干扰。

洗涤：用 ddH₂O 清洗切片两次，每次 5 min。用 PBS 在摇床上洗 1 遍，每次 5 min。

用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，降低非特异性结合背景。37℃ 孵育 30 min。

常用试剂：

      • 3% H₂O₂（封闭内源性过氧化物酶）

      • 正常山羊血清

      • BSA封闭液

洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

选择合适的一抗，并用稀释液 (PBS、TBS 等) 稀释一抗至合适的比例。使用移液器将稀释后的一抗均匀覆盖样本区域，置于湿度平衡的孵育盒中，37℃ 恒温孵育1h或4℃过夜。建议：优先使用经过IHC验证的抗体。

洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。针对易脱片样本，采用 37℃ 预温的温和洗脱缓冲液，轻柔洗涤 5-20 分钟，以维持组织完整性同时有效去除非特异性结合。

抗体选择原则

✓ 定位明确

✓ 特异性良好

✓ 文献支持充分

✓ FFPE验证通过

选择合适的HRP标记二抗，并用稀释液 (PBS、TBS 等) 稀释二抗至合适的比例。37℃ 恒温孵育1h，注意避光和干片。

洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

这是TSA-mIHC最关键的一步。

在玻片上滴加 100 μL 染色工作液，浸没样本，37℃孵育30min。HRP催化荧光标记的酪胺（Tyramide）分子将沉积于抗原周围。形成共价结合荧光信号。

洗涤：用 PBS 在摇床上洗 3 遍，每次 5 min。

特点：

✓ 高灵敏度

✓ 信号放大

✓ 后续修复不易丢失

在组织上滴加抗体洗脱液，37℃孵育15min。

目的：去除当前轮次抗体，保留已经沉积的荧光信号，这样即可进行下一轮染色。

从 "封闭" 开始，重复步骤 封闭 → 一抗孵育 → HRP二抗孵育 → TSA荧光沉积 → 抗体剥离。

按照Panel设计顺序完成2-6个标志物，甚至更多标志物检测。

经验原则：

✓ 高表达抗原优先染色

✓ 弱表达抗原后染色

✓ 避免信号覆盖。

所有标志物完成后。滴加 DAPI 工作液到样本上，室温孵育 5 min，PBS 洗涤3次，，每次 5min。将液体甩干，在组织上滴加抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。

将做好的荧光切片置于4℃避光保存。

作用：

✓ 细胞计数

✓ 细胞分割

✓ 空间分析基础

切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

通过专业软件完成：光谱拆分、细胞分割、表型分析、空间分析等。