口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒说明书

口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒说明书

【用途】

用于检测牛、羊和猪等偶蹄动物血清样品中口蹄疫病毒A型抗体，适用于动物疫苗免疫抗体定量检测。

【规格】1*96T/盒或5*96T/盒

【试剂盒组成】

注：不同批号试剂盒中各组分不得混用。

【贮藏条件及有效期】2～8℃保存，有效期为12个月。

【用法与判定】

在使用前，所有的试剂盒组份应恢复到室温。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。

1．试剂准备

洗涤液配制：将浓缩20×洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释成洗涤液(1×)，即1份浓缩20×洗涤液加入19份蒸馏水，配制的洗涤液(1×)用于洗板和血清样品稀释。

病毒抗原：口蹄疫A型抗原已稀释至工作浓度，直接使用。

2．操作步骤

取出包被板，根据不同的需要，选择图1或图2中的一种布局进行操作。图1为可检测10份样品布局图；图2为可检测20份样品布局图。每次试验，每板均需设置阴阳性血清对照及4孔不加血清单病毒抗原对照。

2.1待检样品稀释：

以图1为例操作，首先，在包被板上，A1～A10每孔各加75µl的洗涤液(1×)，在第1～11列其它所有孔以及第12列的A12～B12内各加入50µl的洗涤液(1×)。其次，再在A1～A10每孔各加25µl的待检样品，A11孔加50µl的阳性对照，A12孔加50µl的阴性对照，然后，以50µl/孔的量，用洗涤液(1×)连续2倍稀释每份被检血清，使每孔最终量都为50µl；

待检样品A1～A10分别以50µl/孔的量从A到H连续2倍稀释；

阳性对照A11以50µl/孔的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照A12以50µl/孔的量从A到B连续2倍稀释。E12~H12孔为病毒抗原对照孔。

待检样品在第1～10列从1:4稀释至1:512；阳性对照，从1:2稀释至1:256，由于试剂盒提供的阳性对照已1:8稀释，则变为从1:16稀释至1:2048；阴性对照，从1:2稀释至1:4。

图1  96孔包被板检测10份样本布局图

以图2为例操作，首先，在包被板上，A1～A10孔以及E1～E10孔，每孔各加87.5µl的洗涤液(1×)，在第1～11列其它所有孔以及第12列的A12～B12内各加入50µl的洗涤液(1×)。其次，再在A1～A10孔以及E1～E10孔，每孔各加12.5µl的待检样品，A11孔加50µl的阳性对照，A12孔加50µl的阴性对照，然后，以50µl/孔的量，用洗涤液(1×)连续2倍稀释每份被检血清，使每孔最终量都为50µl；

待检样品A1～A10分别以50µl/孔的量从A到D连续2倍稀释；待检样品E1～E10分别以50µl/孔的量从D到H连续2倍稀释；

阳性对照A11以50µl/孔的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照A12以50µl/孔的量从A到B连续2倍稀释。E12~H12孔为病毒抗原对照孔。

待检样品在第1～10列从1:8稀释至1:64；阳性对照，从1:2稀释至1:256，由于试剂盒提供的阳性对照已1:8稀释，则变为从1:16稀释至1:2048；阴性对照，从1:2稀释至1:4。

图2  96孔包被板检测20份样本布局图

2.2加病毒抗原：使用已稀释好的口蹄疫A型抗原加样，其中预设的4孔病毒抗原对照孔按100µl/孔加入，其余待检血清、阴阳性对照按50µl/孔加入。加样完毕，所有样品孔和阴阳性对照孔稀释度翻倍，变为图1、图2所示。振荡混匀，封板，37℃温育30分钟。

2.3洗板后加酶：弃去孔中液体，用洗涤液(1×)以300µl/孔的量连续洗涤4次，拍干孔中残留液体。然后按100μl/孔加入酶标抗体，振荡混匀，封板，37℃温育30分钟。

2.4洗板后加底物：弃去孔中液体，用洗涤液(1×)以300µl/孔的量连续洗涤4次，拍干孔中残留液体。然后100μl/孔加入底物溶液(显色液A和B按1:1混合均匀)，封板，37℃避光温育15分钟。

2.5终止后读数：按50μl/孔加入终止液终止反应，立即在450nm波长下读取OD值。

3．结果判定

3.1试验成立条件

每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照OD_450nm值应在1.0以上。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应<1:8。

3.2血清抗体效价的判定

病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低OD_450nm值，计算剩余2孔的平均OD_450nm值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD_450nm值。被检血清OD_450nm值>临界值的孔，判为阴性孔；被检血清OD_450nm值≤临界值的孔，判为阳性孔。

若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD_450nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于2孔之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如处于1:64(反对数值为1.8）与1:128（反对数值为2.1）之间，则判定该份血清的抗体效价为1:90（反对数值为1.95），具体判定可见抗体效价计算对照表。

抗体效价计算对照表

3.3结果判定

阳性：血清样品抗体效价≥1:128，判为口蹄疫A型抗体阳性；

阴性：血清样品抗体效价＜1:64，判为口蹄疫A型抗体阴性；

可疑：血清样品抗体效价在1:64-1:128之间，判为可疑；可疑血清样品需要复检，复检抗体效价≥1:128，判为阳性；抗体效价＜1:128，判为阴性。

3.4 ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系

牛、羊：抗体效价≥1:128，99%以上保护；效价≤1:16，不保护；效价在1:22~90之间，50%保护。

猪：≥1:64，99%以上保护；效价<1:4，不保护；效价在1:4~45，50%保护。

【注意事项】

1. 实验前请仔细阅读本说明书。

2. 使用前需确认试剂盒有效期，应在有效期内使用。

3. 所有试剂使用前恢复至室温(18～26℃)，以免温度过低影响抗原抗体反应。

4. 试剂盒所有浓缩试剂在低温放置下，可能有无机盐结晶，如果有结晶盐出现，可在37℃温育至溶解后使用，不影响实验。

5. 实验前应用温度计检查温箱温度，温度过高或过低影响OD值高低。

6. 待检血清样品数量较多时，应尽量缩短加样时间。

7. 包被板反应时严禁堆叠放置，应该平铺且板间有空隙，不要离温箱壁太近。

8. 终止反应后应立即用酶标仪读数，应在10分钟内完成。

9. 实验所用移液器及设备应定期校准。

10. 采集的样品要新鲜，并且最好不要溶血。血清标本在2～8℃放置不要超过2天，室温不超过8小时，如需长时间放置应储存于-20℃。