苜蓿黄萎病菌探针法荧光定量PCR试剂盒技术支持

苜蓿黄萎病菌探针法荧光定量PCR试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品核酸模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。

5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。

本产品只能用于科研。

探针法的如下：

一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光RT-PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。

3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

8.用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNAout或免提取核酸释放剂。

三、Probe qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：（详见随货说明书或向客服咨询）

数据处理

12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于36。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于36则为阳性。如果在36-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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