凝胶过滤层析实验优化小技巧

凝胶过滤层析是一种基于样品和杂质分子大小差异实现分离纯化的经典而高效的层析技术。虽然凝胶过滤层析分辨率较高，面对难以分离的杂质经过适当的优化往往可以达到更高的纯度。接下来，小优就带大家看看有哪些优化的小技巧吧。

1、凝胶过滤层析选择三步法

想要达到尽可能高的分辨率，选择合适的产品非常重要。凝胶过滤层析的选择可以按照三步策略：选择合适的分离范围，使用合适的上样量，以及尽可能选择粒径较小的层析柱。

（1）选择合适的分离范围

在购买层析柱或者选择实验室已有的层析柱时，首先应关注层析柱适合的分离范围。例如下图所示，不同的层析柱适合的蛋白分离范围也有差别，表明层析柱在这个分子量范围内具有最佳的分离效果。目标蛋白的分子量应在层析柱的分离范围内，如果多个层析柱分离范围有重叠，则目标蛋白的分子量在分离范围靠近中间较好。

（2）使用的合适的上样量

凝胶过滤层析对上样量有限制，根据实验目的的不同，Cytiva也为客户提供多种不同规格的层析柱。普通的10/300的柱型，柱体积是24ml，上样量最大为500ul；3.2/300和5/150柱型则适合于更小的上样量；如果上样量较大，也可以选择120ml和320ml的Hiload柱型，最大可上样13ml。

（3）尽可能选择粒径较小的层析柱

在购买和选择层析柱时，每个层析柱都会标明里面填充的凝胶小球的粒径。粒径较大的凝胶小球流速快，反压小，但通常分辨率不高。如果想要达到较高的纯度，应尽可能选择粒径较小的层析柱。如下图，Superdex Increase系列粒径为9um，是高分辨率的优选。

Superdex™ 预装柱高分辨率优选半制备纯化

2、凝胶过滤层析二倍原则

凝胶过滤层析当目标蛋白和杂蛋白分子量相差1倍以上时，可以得到较高的分离效果。如果目标蛋白和杂蛋白分子量相差不大，也可以考虑使用离子交换等其他层析技术进行分离。

3、柱高的优化

凝胶过滤层析在分离时需要有较长的路径，因此柱高越长，分离效果会越好。一般柱高增加一倍，分辨率可以提高约40%。因此，如果是出于分离目标蛋白和杂蛋白的目的，应选择较长的10/300的柱子，5/150的柱子更适合于做快速筛选。

如果选择空柱自己填装，也应在确定柱体积的情况下，尽可能选择直径较小，柱高较长的“细长型”的柱子，可以达到更高的分辨率。

如果实验室没有较长的层析柱，也可以选择将两个层析柱串联使用，以提高纯度。

4、运行流速的优化

在不改变层析柱的情况下，如果想尽可能提高纯度，可以适当降低流速。有数据表明，降低运行流速有利于提高分辨率，但也会增加时间成本。初次实验可以参考说明书上的推荐流速进行。此外，如果样品粘度较高，或者在低温时运行实验时，应适当降低流速。

5、样品上样体积的优化

在不改变层析柱的情况下，如果想尽可能提高纯度，可以适当减少上样体积。有数据表明，较少上样体积有利于提高分辨率，凝胶过滤层析柱的上样量通常建议为层析柱柱体积的2%-5%，如果样品量较大，可以使用超滤管进行样品浓缩后再上样。