标签蛋白纯化（亲和层析）实验问题自查方法及优化小技巧

亲和层析是一种基于生物分子间特异性相互作用的纯化技术，通常用在标签蛋白纯化的第一步。亲和层析实验过程中，特别是纯化新手，遇到一些问题不知道该如何下手，今天小优就带大家来了解一下遇到问题应该怎样自查和优化，让你不再束手无策~

1、没有收集到目标蛋白

问题描述：在蛋白纯化过程中，使用洗脱液对填料上的目标蛋白进行洗脱，在收集液中没有检测到目标蛋白。

问题自查1：蛋白表达情况怎么样？目标蛋白是否有正常表达？标签是否正常表达且没有被折叠覆盖？

（1）蛋白样品在用填料纯化之前，先跑下SDS-PAGE胶并用考马斯亮蓝染色，如果能看到比较清晰且较粗的目标蛋白条带，则表达量较高；

（2）蛋白样品跑WB，用标签抗体检测，如果能检测到目标条带，则标签有正常表达；

（3）检测蛋白样品中的蛋白浓度，并结合SDS-PAGE显示的目标蛋白的占比，可以估算出目标蛋白的表达量;

（4）如果目标蛋白数量较多，且想要拿到比较准确的浓度数据，也可以使用His tag OneStep ELISA Kit（货号S0C3016）进行检测，可以最多一次性同时检测80个样品；

（5）或者也可以考虑在目标蛋白同时加上GFP等荧光标记，通过荧光检测得到蛋白表达量；

（6）如果蛋白上清液中没有检测到蛋白，且在沉淀中有大量蛋白，此时可能是蛋白形成了包涵体；

实验优化1：

如果蛋白表达量不高，需要对前期质粒构建和蛋白表达过程进行优化。例如更换表达载体，更换标签，进行密码子优化，筛选大肠杆菌培养温度和时间，筛选诱导剂（如IPTG）浓度，诱导温度和时间等；

问题自查2：目标蛋白到哪里去了？是没有结合在柱子上，还是在柱子上没有洗脱下来？

同时收集上样和洗杂时的流穿液以及洗脱目标蛋白时的洗脱液，如果流穿液中有大量的目标蛋白，则表示目标蛋白没有和填料有效结合；如果流穿液和洗脱液中都没有目标蛋白，则表示目标蛋白可能还结合在柱子上，没有洗脱下来；

实验优化2：

流穿液中有目标蛋白：

（1）His标签

● 样品或结合缓冲液条件不合适：样品和结合缓冲液中不能含有高浓度的金属螯合剂（例如EDTA），高浓度强还原剂（例如DTT），或者高浓度的咪唑；

● His标签和填料结合较弱：适当降低上样流速并增加孵育时间；增加His标签的数量（6-10个）；

● 调整结合缓冲液的PH为7-8，PH过低会影响蛋白结合；

● 上样量超出填料载量：使用更大体积的层析柱；

（2）GST标签

● 样品制备超声过度：使用温和的超声条件；加入溶菌酶促进裂解；

● GST氧化聚集：加入DTT（1-10 mM）增加蛋白的结合；

● 调整结合缓冲液的PH为6.5-8，在纯化前平衡层析柱；GST结合动力学慢，可降低上样流速；提高样品浓度有利于目的蛋白结合；

● 上样量超出填料载量：使用更大体积的层析柱；

目标蛋白没有洗脱下来：

（1）His标签

● 洗脱条件过于温和：适当增加洗脱缓冲液中的咪唑浓度，或者尝试降低洗脱液的PH；增加洗脱步骤和时间；

● 目标蛋白与填料发生非特异性结合：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如2% Triton X-100），或者增加洗脱液中NaCl的浓度；

● 目标蛋白在填料上发生了沉淀：减少上样量，添加去垢剂或者在变性条件下进行洗脱；

（2）GST标签

● 增加洗脱缓冲液的用量，增长洗脱时间；

● 适当提高洗脱缓冲液中还原型谷胱甘肽的浓度（20-40 mM）；

● 洗脱缓冲液PH过低：提高PH至8-9可促进洗脱；提高洗脱液中的离子强度（适当增加0.1-0.2 M NaCl）；适当加入DTT（1-10 mM）抑制还原型谷胱甘肽被氧化；

● 目标蛋白和填料间发生非特异相互作用：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如0.1% Triton X-100）；

2、蛋白纯度不高，杂带较多

问题描述：收集液中有目标蛋白，但同时也有很多杂蛋白。这种情况一般发生在使用His标签时，以下主要对His标签蛋白纯化进行讲解。

问题自查1：是否目标蛋白本身表达不高，而杂蛋白表达较高；按照问题1中的方法检测目标蛋白表达；

实验优化1：优化质粒构建和蛋白表达的步骤；

问题自查2：蛋白是否容易降解？

在SDS-PAGE胶上观察杂带的分子量；如果杂带的分子量比目标蛋白分子量小，且相差值约为几个结构域或特定酶切位点，说明可能该杂带是由目标蛋白降解产生的。

实验优化2：

在裂解液和缓冲液中添加蛋白酶抑制剂（EDTA除外）；整个实验保持在低温下进行；尽量缩短前期样品处理的时间；使用Cytiva带有预过滤滤膜的HisTrap FF Crude柱子（货号29048631），样品无需过滤直接上样，减少前期处理时间。

其他实验优化：

● 杂蛋白对填料也有较强的结合：优化结合，洗脱条件；增加后续其他的纯化步骤（离子交换，凝胶过滤等）；替换其他的标签；构建双标签目标蛋白；尝试使用其他的金属离子（例如Co2+，货号29048565）;

● 杂蛋白与目标蛋白存在非特异结合：裂解液和缓冲液中添加去垢剂（2% Triton X-100/Tween 20）；或添加甘油（20%以内）；增加缓冲液中NaCl浓度至500 mM；

● 洗杂过程优化：在结合缓冲液中添加10-20 mM咪唑；重复洗杂的步骤；

● 梯度洗脱：使用咪唑梯度浓度洗脱；

3、柱子堵了

问题描述：柱子发生堵塞，流速降低，压力增高；此时需要根据说明书对层析柱进行清洗。

问题自查1：样品和缓冲液上样前有没有过滤？

实验优化1：收集到蛋白样品之后，建议先用超声破碎，然后离心取上清，然后使用0.45um或者0.2um的滤膜进行过滤；

问题自查2：是否样品浓度或者粘性过高？

实验优化2：可以适当稀释样品；如果样品粘性比较高，也可能是样品中含有高浓度的宿主核酸，可以增加超声时间，或者加入核酸酶（5 ug/ml DNase1,1 mM Mg2+）进行处理。

问题自查3：层析柱有没有定期清洗？

实验优化：层析柱在使用5-10次之后，建议对层析柱进行常规清洗。清洗方法可以参考说明书。

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