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         3T3-L1细胞是一种从小鼠胚胎成纤维细胞中分离得到的细胞系，具有从快速分裂的前脂肪细胞向脂肪样细胞分化的特性。

         最早于1974年由Green和Kehinde等人从小鼠胚胎中分离得到。由于其具备在体外分化为类脂肪细胞的能力，这种细胞系被广泛用于研究脂肪细胞的分化、代谢以及肥胖和糖尿病等代谢性疾病的发病机制。

         对于诱导效果的检测有多种方式，其中油红O染色是检测脂肪细胞脂滴积累的经典方法，可用于直观评估细胞的脂肪化程度。油红O是一种脂溶性染料，能够特异性结合细胞内的中性脂质，形成红色的脂滴。可以在显微镜下观察脂滴的形成，当观察到脂滴数量和大小的增加则表明诱导分化成功。

         另外也可以通过分子标志物检测的方式来判断诱导效果，比如通过检测脂肪细胞特异性基因或蛋白的表达，评估细胞的分化程度。常用的基因标志物包括PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、aP2（脂肪细胞脂肪酸结合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等。或者通过Western Blot检测基因所对应的蛋白表达水平。此外，诱导分化后的3T3-L1细胞形态会发生显著变化，细胞内出现大量脂滴。此形态学变化也可作为是否成功诱导的初步判断依据。

         本篇以六孔板为例，介绍3T3-L1细胞分化为脂肪样细胞的实验方案。

第 1 阶段   细胞培养

1.以每平方厘米3×103个细胞的密度将细胞接种于六孔板中。

        注意：

     （1）建议使用早代次的细胞进行实验，以确保分化效果。

     （2）铺板需均匀，铺板不均匀可能会导致分化不均匀，分化比例低，分化过程中细胞漂浮。

2.在DMEM中培养细胞，直至达到70%的汇合度，每2-3天更换一次培养基。

         3T3-L1细胞通常在DMEM高糖培养基中培养，加入10%小牛血清或胎牛血清以促进细胞生长。细胞在培养箱中（37℃，5% CO₂）生长至汇合度达到90%左右时，即可进行分化诱导。

         分化前的汇合度不应超过70%，否则会增加分化后的细胞死亡。

        注意：

     （1）使用高血清含量的培养基可以促进脂肪积累。

     （2）细胞密度是影响分化效果的关键因素，汇合度过高或过低都会影响分化效率。

第 2 阶段   分化诱导培养基配制

         培养基制备必须在组织培养箱中无菌条件下进行。MDI（甲基异丁基黄嘌呤IBMX、地塞米松、胰岛素）诱导培养基和胰岛素培养基应新鲜制备。

实验步骤

1.制备储备溶液。

         在DMSO中制备 IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如果使用冻干胰岛素，请根据制造商的说明进行复溶。

2.配置100 mL MDI诱导分化培养基。

3.配置胰岛素培养基。

         在DMEM中加入胰岛素至最终浓度为10 µg/mL。

第 3 阶段   3T3-L1 细胞向脂肪样细胞的分化

实验步骤

1.从培养箱中取出细胞培养板，去除DMEM培养基，并每孔添加2-3 mL MDI诱导培养基（记为第0天）。

        注意：

     （1）3T3-L1细胞添加诱导剂时，手法要特别轻，加液时尽量让枪头沿着侧壁缓慢加入，减小对细胞的冲击，防止细胞卷边飘起。

     （2）诱导培养基需要提前37℃预热后使用，减小对细胞的刺激。

2.第3天，从细胞中去除MDI诱导培养基，并用2-3 mL胰岛素培养基替换。

3.第6天，去除胰岛素培养基并添加新鲜的DMEM。

4.一般到第7-10天，能获得完全分化的脂肪样细胞。

5.分化效果检测。可以通过油红O染色来追踪向脂肪细胞样细胞的分化，以监测脂质积累，或通过监测脂肪细胞标志物（例如脂联素和 FABP4）的表达来追踪。

         注意：饱和油红O染色液不容易着色，染色前油红O染色液需要根据说明书进行稀释。

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