武汉德晟生化科技有限公司

在化学分析与生物检测领域，显色试剂DA64 - DA67的使用涵盖了从显色溶液的精确配制、样本与显色溶液的反应孵育，到吸光度检测与结果确定等一系列严谨的操作步骤。只有严格按照这些步骤进行操作，才能充分发挥DA64 - DA67的显色性能，为化学分析与生物检测提供准确、可靠的数据。

一、用于常规样本检测的显色溶液制备与操作 
1、显色溶液的精确配制：在准备配制显色溶液前，需确保实验环境清洁，所用仪器如容量瓶、移液器等均经过校准且洁净干燥。取4.08 mg DA67，这一质量的准确称取是关键，其直接关系到最终显色溶液的浓度准确性。将称取好的DA67放入预先配置好的PIPES缓冲剂中，PIPES缓冲剂能为DA67提供稳定的溶解环境，维持合适的酸碱度，保证DA67的化学性质稳定。接着，加入1 mL浓度为100 units/mL的过氧化物酶（POD）。过氧化物酶在后续的显色反应中扮演着关键的催化角色，其活性和加入量的准确性对反应进程和结果影响显著。将上述混合物在容量瓶中用PIPES缓冲剂定容至100 mL，通过精确的定容操作，得到浓度为100 μmol/L的DA67溶液。在定容过程中，需平视容量瓶刻度线，确保溶液体积准确无误，获得浓度均一、稳定的显色溶液。

2、样本与显色溶液的混合反应：取上述制备好的DA67溶液3 mL，转移至洁净的反应容器中。同时，准备10 μL样本溶液，样本溶液中含有不同浓度的H₂O₂，浓度范围为0 - 5 mmol/L。将样本溶液小心加入到DA67溶液中，确保两者充分混合。此混合过程需轻柔操作，避免产生过多气泡，影响后续反应。 将混合后的溶液置于37°C的环境中培育5分钟。37°C是模拟人体生理温度的常用条件，在此温度下，过氧化物酶能发挥最佳活性，催化DA67与H₂O₂之间的显色反应。培育时间的精准控制也很重要，时间过短可能导致反应不完全，无法产生足够的显色效果；时间过长则可能引发副反应，干扰检测结果。 

3、吸光度检测与结果确定：培育完成后，使用分光光度计检测溶液在666 nm处的吸光度。分光光度计需提前预热并校准，确保测量数据的准确性。在测量时，需以空白溶液作为对照，空白溶液是用蒸馏水替换样本溶液后混合而成的溶液。通过测量空白溶液的吸光度，并将其从样本溶液的吸光度中减去，得到的吸光度差作为最终检测值。为了确定样本中H₂O₂的含量，需要预先制作校准曲线。校准曲线是通过使用已知浓度的H₂O₂标准溶液，按照与样本溶液相同的操作步骤进行反应和测量吸光度，以H₂O₂浓度为横坐标，吸光度差为纵坐标绘制而成。通过将样本溶液的检测值与校准曲线进行对比，即可准确确定样本中的H₂O₂含量。

 
二、用于检测POD活性的显色溶液制备与操作 
1、准备另一种显色溶液用于检测POD活性时，同样先确保实验仪器的准确性和洁净度。称取4.08 mg DA67，加入到已配置好的Mcllvaine缓冲液中，该缓冲液的pH值为5.7，能为DA67和后续反应提供特定的酸碱环境，利于反应的进行。向其中加入1 mL浓度为2%的H₂O₂。H₂O₂在此反应体系中作为底物，与DA67在POD的催化下发生显色反应。将上述混合物在容量瓶中用Mcllvaine缓冲液定容至100 mL，通过精确的定容操作，得到用于检测POD活性的显色溶液。
2、样本与显色溶液的孵育反应：取上述制备的显色溶液2 mL，转移至洁净的反应容器中。同时，准备2 mL样本溶液，样本溶液中含有不同浓度的POD，浓度范围为1 fmol - 1 pmol/tube POD。将样本溶液与显色溶液充分混合，轻柔搅拌，保证两者均匀接触。将混合后的溶液在37°C下孵育。在此温度下，POD能够催化DA67与H₂O₂之间的显色反应，使溶液颜色发生变化。孵育过程需保持环境温度稳定，避免温度波动影响POD的活性和反应进程。 
3、吸光度检测与POD活性确定：孵育结束后，使用分光光度计检测溶液在666 nm处的吸光度。同样，需以空白溶液作为对照，减去空白溶液的吸光度后，得到的吸光度差作为检测值。预先制作用于检测POD活性的校准曲线，该曲线是通过使用已知浓度的POD标准溶液，按照与样本溶液相同的操作步骤进行反应和测量吸光度，以POD浓度为横坐标，吸光度差为纵坐标绘制而成。通过将样本溶液的检测值与校准曲线进行对比，即可准确确定样本中的POD活性数值。

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