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酪蛋白是牛乳中含量最多的蛋白质，约占牛奶总蛋白质的80%。其中，β-酪蛋白约占酪蛋白的30%左右。有研究显示，由于奶牛的杂交和基因突变等因素的影响，牛乳中β-酪蛋白有多达10余种变异体，其中以A1和A2为比较常见的变异体。

A2β-酪蛋白（A2，β-casein-A2）在消化过程中不会像A1β-酪蛋白（A1，β-casein-A1）一样产生β-酪啡肽-7（BCM-7），而BCM-7可能与过敏、消化吸收障碍有关。A1和A2β-酪蛋白区别在于第67位氨基酸的不同，这种分子结构细微的差别，为后期分离和纯化带来了挑战，也是市面上还无商业化的A1和A2蛋白标准品可供使用的重要原因。来自乳业生物技术国家重点实验室的研究人员在实验研究中，借助大肠杆菌蛋白表达系统，通过构建特定β-酪蛋白变异体表达系统，探索了A1和A2β-酪蛋白生物合成的可能性。这也将帮助科研人员为后续乳蛋白定向合成以及相关乳制品的A1和A2蛋白定量检测提供基础。

通过在Uniprot数据库中查找β-酪蛋白有224氨基酸序列（P02666），其中在N端包含15个氨基酸组成的信号肽序列。根据A1和A2蛋白在氨基酸组成上的差异分别得到对应的氨基酸序列设计相应的碱基序列。根据设计对应的碱基序列和相应的带Nde I和Xho I酶切位点的引物进行目的片段的克隆。

通过Prot Param软件对A1和A2蛋白氨基酸序列进行分析得到对应蛋白质理化性质，A1和A2蛋白分子量在25 kDa左右，亲疏水性基本相同。

分别构建含有CSN2-A1和CSN2-A2目的基因的重组质粒载体pET28a（+）-CSN2-A1和pET28a（+）-CSN2-A2。将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和纯化。结果表明，在0.2 mmol/L IPTG，37 ℃下诱导表达4 h可获得大量蛋白，但通过SDS-PAGE电泳显示目的蛋白以包涵体形式表达，存在于细胞破碎后的沉淀中。通过洗涤、溶解、镍柱亲和色谱纯化、复性以及鉴定等步骤最终可获得纯度大于90%（PAGE）的A1和A2重组蛋白。

不同A1/A2重组菌体诱导表达SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果

注：M：Marker；1：未诱导；2~6：诱导后不同单克隆菌株

实验结果表明A1和A2包涵体蛋白经过清洗、复溶和纯化后在25 kDa附近出现目的蛋白条带以外基本无其他杂蛋白，因此达到了预期纯化目标。

A1和A2重组表达菌株诱导后得到的沉淀样、复溶以及纯化后样品SDS-PAGE电泳图

注：M：Marker；1：破碎后沉淀；2：破碎溶解后上清；3：过柱流出液；4：清洗样；5：洗脱样

包涵体通过纯化后利用透析袋进行复性，得到复性后的重组的A1和A2蛋白样品。SDS-PAGE检测后呈单一条带，且纯度超过90%。

A1和A2蛋白作为β-酪蛋白两种常见的变异体类型，由于两者在分子结构上的细微差异使其在用常规方法制备和纯化上存在困难。这项研究最终获得的A1和A2重组蛋白含量分别为1.5和2.0 mg/mL，这也为人工合成特定变异体的β-酪蛋白提供了新的借鉴。

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