FITC标记抗体

FITC标记抗体是将FITC与特异性抗体经适当方法连接而成，FITC（异硫氰酸荧光素）能与各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，其应用范围非常广泛，结果即时可见、敏感性高。

FITC异硫氰酸荧光素是一种常用的标记抗体的方法。FITC一般为黄色。棕色或棕色粉末或结晶，在低温下可保存数年。在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。抗体分子最多可标记15~20个FITC分子。标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力，在荧光源紫外线或蓝紫光的刺激下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜观察或使用流细胞仪进行分析，从而定性、定位或定量抗原。

（1）用500ml FITC标记缓冲液在4℃透析纯化的单抗，共2d。期间更换2或3次缓冲液（通常情况下，5ml的1-2mg/ml的抗体可以用500ml缓冲液）。在A280处检测吸光度，确定抗体浓度（=A280×0.74×稀释倍数）。

（2）每毫克抗体加入20微升的5mg/ml FITC。室温孵育2h。

（3）用透析液透析去除未结合的FITC，共2d。期间更换2或3次缓冲液。或者过Sephadex G-25去除。

（4）用透析液稀释FITC-lgG复合物，使A280＜2.0。在A280和A492处检测吸光度，计算蛋白质浓度。

蛋白质（mg/ml）=A280-（A492×0.35）/1.4（FITC标记抗体摩尔系数的倒数）。