神经节苷脂

Gls有两个基本功能：介导细胞-细胞、细胞-微生物以及细胞-基质间的相互作用。调控细胞质膜中蛋白质的功能，如生长因子受体、离体通道的功能。外源性的Gls可以通过与细胞表面的Gls结合蛋白结合，来改变与Gls相连的激活酶活性，从而增高或减低细胞生长速率。
缺氧缺血性脑损伤的发病机制与多种因素有关。国内外动物实验证实神经节苷脂能通过血脑屏障，预防神经细胞的凋亡，稳定神经细胞膜，维持钙平衡，抗兴奋性氨基酸神经毒性和氧自由基反应，且与神经生长因子协同起神经营养作用。临床上神经节苷基脂用于治疗脑缺血已取得成效。
陈晓隆、潘晓丽等寻找视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)的生物学标志。方法：应用高效薄层色谱法对32例RB瘤组织及21例对照视网膜组织的神经节苷脂进行对照分析。结果：RB瘤组织神经节苷脂结合的唾液酸含量明显低于对照视网膜组织[(0.04±0.01)mg/g(湿重)，(0.11±0.02)mg/g(湿重)，P<0.01]。GM₃、GM₂、GM₁、GD₃及GD₂为RB瘤组织主要成分，对照视网膜组织中则以GM₂、GM₁、GD_1a、GT_1b、GQ_1b为主。傅强、侯铁胜等研究认为神经节苷脂对损伤脊髓组织有明显保护作用，并初步探讨其作用机制，可能是通过对神经细胞凋亡的阻断来发挥作用的。帕金森病(PD)是黑质纹状体的进行性变性疾病。近年来发现神经节苷脂有望缓解该病的症状，延缓该病的进展。
GM₁对老龄大鼠缺氧性脑损害有一定的早期防治作用，作用机制可能与拮抗兴奋性氨基酸毒性作用、防止细胞内钙离子平衡紊乱、减轻自由基损伤、保护膜酶活性等环节密切相关。GM₃含有两个己糖基与一个唾液酸基，可诱导HL-60细胞沿单核巨噬细胞途径分化，能调节J6-2细胞的磷脂代谢。李昭杰、周东等探讨了单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM₁)在急性颅脑损伤治疗中的应用。结果表明：GM₁具有较好的催醒作用，对提高患者的生存质量，降低死亡率，促进脑功能恢复具有较好疗效。张桂林、傅万海观察了神经节苷脂(GM₁)对缺氧缺血(HI)新生大鼠的治疗作用及对凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达的影响。结果表明：应用GM₁治疗HI脑损伤可减少脑细胞凋亡，GM₁治疗对凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达有一定的影响，HI脑损伤后细胞凋亡可能与这两种基因相关。
神经节苷脂GD₃有增强肿瘤本身及邻近组织中血管生成作用，从而促进肿瘤的演进和转移。高罗以、曾桂超等的研究工作为这一假设提供了有力的实验证据，应用GD₃合酶的反意DNA转染肿瘤细胞从而抑制细胞中的GD₃合酶的表达，极大地降低了细胞内源GD₃含量，进一步的研究证明，抑制肿瘤细胞的GD₃合成，明显的降低了该肿瘤细胞的血管内皮生长因子(WVGF)的水平，并使血管生成作用降至最小限度，这些实验说明GD₃在肿瘤的血管生成中具有重要的作用，此外，GD₃作为肿瘤的一种相关抗原，它与血管生成因子的协同效应在联合基因疗法中起到重要的作用。
国内外对肿瘤相关鞘糖脂的研究主要集中在酸性鞘糖脂即神经节苷脂方面，而对中性鞘糖脂研究较少。据Svennerholm L.和张世忠等的报道，中性鞘糖脂的显色方法有两种，其原理类似，主要是由于酸与鞘糖脂中的糖基不可逆性结合，进而根据显色剂不同使得中性鞘糖脂显蓝色或紫红色。张宗城等建立了一种新的中性鞘糖脂显色方法，即碘显色法，显色原理是根据不饱和键能吸引碘原子聚集，在其周围生成棕黄色的物质。由于神经节苷脂中同样含有双键，该显色方法是否适用与神经节苷脂的显色，有待进一步研究。 GM₁主要用于治疗多种原因引起的中枢神经病变，包括常见的脑脊髓损伤、脑血管意外、帕金森病，以及多种病因引起缺氧缺血性脑病(新生儿缺氧缺血性脑病、溺水、CO中毒等)。 Gls的制备
方法一、以狗红细胞为原料
按Ledcen等与Kanfer等的方法进行。用氯仿/甲醇混合液(2：1，1：1，1：2)依次提取得总脂质。经DEAE-Sephadex A-25离子交换柱处理，除去中性脂类。再经碱水解除磷脂、透析、Iatrobeads吸附柱层析，制得总Gls。
方法二、以猪脑为原料
粗Gls的制备 取500g新鲜猪脑，加10倍体积的等体积氯仿和甲醇的混合溶液，相继在电动匀浆器的超声波细胞粉碎机中匀浆，在4℃下搅拌提取过夜，离心取上清液，沉淀物用上述混合溶液再次匀浆，反复提取3次，合并上清液，40℃减压蒸发浓缩至原体积的1/4，置-20℃冰箱过夜，过滤，按滤液1/5体积加5%NaCl：甲醇=1：1(体积比)的混合溶液进行Folch分配，使Gls转入水相，收集上层液，下层进行多次分配，合并上层液，至40℃减压蒸发浓缩除去甲醇，浓缩液4℃透析至无Cl^-为止，冷冻干燥，制得粗Gls。
新鲜猪脑[混合溶液]→[4℃，提取3次]离心→上清液[浓缩]→浓缩液[冷藏]→[-20℃]过滤→滤液[混合液]→[Floch分配]上层液[浓缩，透析]→[冷冻干燥]粗Gls
离心液相层析
装盘 取已活化的层析硅胶170g，按氯仿：甲醇=7：1(体积比)的比例加入混合溶液700ml，混匀，缓慢注入直径为30cm，高1cm的离心液相色谱盘中孔，转速为400r/min，待色谱盘充满硅胶后，按氯仿：甲醇：水=7：3：0.5 (体积比)的比例加入混合溶液洗脱，以除去杂质至洗脱液无色为止。
上样、洗脱和收集 将粗Gls溶于50-80ml 0.1mol/L NaOH甲醇液中，37℃保温2h后(去磷脂)，用0.5mol/L HCl甲醇溶液中和至中性，透析，冷干，得Gls干粉。将Gls干粉溶于氯仿：甲醇=7：1(体积比)的混合溶液，离心除去不溶物，取上清液进样。待样品上完后，用3倍盘体积的上述溶液洗脱，然后改用5倍盘体积的氯仿：甲醇：水=6：4：1(体积比)的混合溶液洗脱并收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，称重，得Gls。
粗Gls[处理]→Gls干粉[混合溶液]→[离心]上清液[进样、洗脱、浓缩]→[冷冻干燥]Gls
Sephadex LH-20层析 取Sephadex LH-20，加5倍体积含0.3mol/L KOH的甲醇：水=95：5(体积比)的混合溶液，4℃浸泡过夜，除去细小颗粒，次日改用甲醇：水=95：5(体积比)的混合溶液以除去KOH，将处理好的Sephadex LH-20灌入层析柱(内径3cm，柱长100cm)至床高约85cm，加甲醇：水=95：5(体积比)的混合溶液平衡，将由离心液相色谱仪(Clc)得到的Gls，溶于10ml含 0.3 mol/L KOH的氯仿：甲醇=95：5(体积比)的混合溶液中，37℃保温2h后，离心，上清液进行层析，用甲醇：水=95：5 (体积比)的混合溶液洗脱收集，待收集液呈碱性后，停止收集，合并各管，浓缩，冷冻干燥，制得精品Gls，按脂结合唾液酸(LBSA)计含量为30.1%，含5种Gls，即GM₁为19.5%、GD₃为 13.8%、GD_1a为27.8%、GD_1b为14.2%和GT_1b为19.3%。
Gls[混合溶液]→[离心]→上清液[进样、洗脱、浓缩]→Gls精品
粗Gls提取方法基本上与Yu氏法相似，只是增加-20℃冷藏过夜，此步骤的目的是除去中性脂类，有利于节省后继步骤的溶剂用量、时间和提高Gls的含量。经测定脂结合唾液酸含量为12%，而未冷藏只能达8%-9%，产率为0.35%。与Katsumi所得的0.34%相似，高于夏氏的0.25%。
离心液相色谱仪(Clc)进行Gls纯化是一种新方法。该仪器基本原理是根据混合样品中各组分质量不同，在固定相和流动相分配作用不同以及所受离心力不同，从而提高分离效果。
方法三、以牛脑为原料
将牛脑的氯仿-甲醇提取液通过水萃取使神经节苷脂与脂溶性成分分离，再经碱水解除磷脂，上吸附树脂柱，使与水溶性杂质分离，然后作产品鉴定。结果：所制备的神经节苷脂的纯度为唾液酸含量26%；组成成分：GM₁16%、 GD₃6%、GD_1a45%、GD_1b10%、GT_1a14%、GT_1b17%。
二、GM₃的制备(以狗红细胞为原料)
按Ledcen等与Klenk等的方法进行。经氯仿/甲醇混合液提取，5次Folch分配，保留水相。再经DEAE-SephadexA-25离子交换柱层析分离出单唾液酸部分，经乙酰化、Florisil吸附柱层析、去乙酰化、透析、冻干，制得GM₃纯品。
有关资料表明：从猪脑提取纯化GM₁；从兔肝提取GM₂；从猪肝提取GM₁和GD₃；狗肝中GD_1a与GT_1b含量较大。