L-2-氯苯丙氨酸

3752-25-8

103616-89-3

以2-氯肉桂酸为原料合成L-2-氯苯丙氨酸的一般步骤如下：首先，根据Rhodosporidium toruloides ATCC 10788的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）蛋白质序列（NCBI蛋白质数据库编号CAA31209），由Genscript Corporation合成R. glutinis的PAL基因，并进行密码子优化以适应大肠杆菌表达。合成的PAL基因通过Genscript连接到pUC57载体的SmaI位点，构建成pUC57_PAL质粒。将5μg冻干的pUC57_PAL质粒溶解于50μl MilliQ水中，取1μl溶液转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞，按照供应商的协议进行操作。转化后的细胞在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB固体培养基上于37℃过夜培养。挑选单一菌落接种于20ml含100μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中，制备8%甘油的菌液并保存于-80℃。将含有pUC57_PAL的DH5α菌株接种于1000ml含100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中，28℃过夜培养。随后，将培养物接种于10升TB培养基（含0.1g/l羧苄青霉素和1mM IPTG）中，37℃搅拌发酵9.5小时，转速500至1500rpm。通过离心收集细胞，获得230g湿细胞，分装成10g等分试样储存于-20℃。反应前，将适量细胞解冻并重悬于冷水中。将1.8g（10mmol）3-(2-氯苯基)-丙烯酸溶于0.5L 13vol%氨水溶液中，用25w/w% H2SO4调节pH至11。将130g湿细胞重悬于0.2L pH11的13vol%氨水溶液中，与底物溶液混合，总体积调节至1L。反应在30℃、200rpm的密闭容器中进行。初始1小时内，每5分钟加入0.91g（5.0mmol）3-(2-氯苯基)-丙烯酸，随后7小时内每25分钟加入相同量。8.5小时后，离心去除细胞，HPLC测定反应产率约91%，得到约18.1g（91mmol）2-氯苯丙氨酸。上清液（850mL，pH10.8）减压浓缩（150至10mbar，60℃），去除约65%水后形成沉淀（pH7.5）。过滤沉淀，水洗去除无机盐，干燥得14.9g产物，其中含57w/w% N-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸（8.5g，47%产率），24w/w%水和1.7w/w% 3-(2-氯苯基)-丙烯酸。(S)-2-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸的对映体过量（e.e.）为99%。母液中剩余9.5g (S)-2-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸。

参考文献：

[1] Patent: EP1676838, 2006, A1. Location in patent: Page/Page column 17-18

[2] Patent: WO2006/69799, 2006, A1. Location in patent: Page/Page column 30-31

[3] Journal of the American Chemical Society, 2015, vol. 137, # 40, p. 12977 - 12983

[4] Catalysis Science and Technology, 2016, vol. 6, # 12, p. 4086 - 4089