乳过氧化物酶(LPO)ELISA试剂盒

双抗体夹心法 本试剂盒应采用双抗体夹心法测定血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中的含量。   大鼠 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。   1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。     本试剂盒应用双抗体夹心法测定鱼标本中过氧化脂质/乳过氧化物酶(LPO)水平。用纯化的过氧化脂质/乳过氧化物酶(LPO)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入过氧化脂质/乳过氧化物酶(LPO)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的过氧化脂质/乳过氧化物酶(LPO)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中过氧化脂质/乳过氧化物酶(LPO)含量。   可检测样本中大鼠的LPO，且与其类似物无明显交叉反应。 乳过氧化物酶是一种从乳腺、唾液和其他粘膜腺体（包括肺、支气管和鼻子）中分泌的过氧化物酶，其功能是对细菌和病毒的天然和第一道防线。它是血红素过氧化物酶家族的成员。它由LPO基因编码。乳过氧化物酶催化过氧化氢对几种无机和有机底物的氧化。这些底物包括溴化物和碘化物，因此乳过氧化物酶可归类为卤代过氧化物酶。另一个重要的底物是硫氰酸盐。通过这种酶的作用产生的氧化产物具有强大的和非特异性的杀菌和抗病毒活性，包括对流感病毒的破坏。乳过氧化物酶与其无机离子底物、过氧化氢和氧化产物一起被称为乳过氧化物酶系统。因此，当提供足够的碘时，LPO被认为是对入侵性细菌和病毒制剂如流感和SARS-CoV-2病毒的非常重要的防御。