基本属性 概述简介原理方法相关技术展望参考文献 用途与合成方法
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免疫沉淀

基本属性 概述简介原理方法相关技术展望参考文献 用途与合成方法
免疫沉淀
免疫沉淀 用途与合成方法
  • 概述免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础,用于研究蛋白质相互作用的经典方法,也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。免疫沉淀技术现已广泛应用于基因、蛋白质以及它们之间相互作用等领域的研究,并且其可与多种技术联合应用,也可合并一些实验方法进行多方面探索。
  • 简介免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)技术是专门研究蛋白质之间或者蛋白质与遗传物质之间相互作用的方法,其凭借特异性强、灵敏度高等优点已逐渐被人们应用于蛋白质与基因的研究领域。
  • 原理方法免疫沉淀技术的基本原理和主要实验方法免疫沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。
    基本原理: 可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下,按适当比例所形成的可见沉淀物,据此沉淀物设计沉淀实验。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的蛋白质-蛋白质间的结合被保持下来,因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质-蛋白质相互作用。如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用,第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测;如果实验目的是发现新的结合蛋白,可以直接对凝胶上蛋白质进行染色来确定。
    实验步骤: ① 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 mL 冷的 EBC 裂解缓冲液中。②将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4 ℃以最大速度离心15 min。③收集上清液并加入30 μg 的适当抗体,4 ℃摇动免疫沉淀物 1 h。④加入 0.9 mL 的蛋白质 A—Sepharose悬液,4 ℃摇动免疫沉淀物 30 min。⑤ 用含 900 mmol.L-1 NaCl 的NETN 洗蛋白 A—Sepharose 混合物,再重复洗 5 次;最后,用NETN 洗 1 次。⑥吸出混合物的液体部分。加入 SDS 胶加样缓冲液到球珠中,煮沸 4 min。⑦将样品加入到大孔的不连续SDS—PAGE 梯度胶中,在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜。⑧如果实验目的是发现新的结合蛋白,通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。对于实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用,第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测。⑨如果实验目的是发现新的结合蛋白,从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用 1 mL50%乙腈洗两次,每次 3 min。⑩用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将多肽电洗脱。使用窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 AB1477A 或 494A 机器上进行自动Edman 降解测序。
  • 相关技术免疫沉淀技术的主要相关技术免疫沉淀技术可以与基因组技术、放射同位素技术、聚合酶链式反应、免疫印迹等实验方法相结合,对较复杂的蛋白质与 DNA/RNA 的关系和定位提供非常好的解决方法。其主要分为染色质免疫沉淀技术、蛋白质免疫沉淀技术和放射免疫沉淀技术等。染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技术染色质免疫沉淀技术是研究体内 DNA-蛋白质相互作用的较为理想的分析手段。基于体内技术而发展起来的染色质免疫沉淀技术分析结合了抗原抗体反应的特异性和聚合酶链反应(PCR)的高灵敏性,可较真实地反映体内基因组 DNA 与蛋白质的结合状况,是目前研究体内染色质水平上基因转录调控的主要技术。
  • 展望免疫沉淀技术的前景展望免疫沉淀技术,是一项专门研究蛋白质相互作用的先进技术,不过其现在也广泛的应用于基因领域的研究,比如转录调节蛋白的作用、靶向蛋白受体的筛选、基因蛋白产物表达的研究、RNA 参与遗传物质复制的方式以及 DNA 修饰的机制等等。免疫沉淀技术拥有灵敏度高、准确度高、特异性强的优点,所以在专一性结合物质的检测和筛选中得到的很好的应用,也成为相应实验中减少实验程序并缩短实验时间的最佳方法之一。
  • 参考文献[1] 翟曜耀,刘晓霞,魏秀芳. 免疫沉淀技术的最新进展[J]. 现代生物医学进展,2010,(10):1997-2000. 
    [2] 杨舸,朱静. 染色质免疫沉淀技术的应用及进展[J]. 检验医学与临床,2009,(05):367-368. 
    [3] 肖颜玉,张莉萍. 染色质免疫沉淀技术研究进展[J]. 国际遗传学杂志,2007,(06):424-426.