核酸探针 用途与合成方法
探针(Probe)通常是指针对某种特定目标物的探测器,基于核酸分子杂交原理的核酸探针(Nucleotide Probe)可理解为一类能特异性识别目标分子(核酸序列)，并适合直接检测或带有可检测标记物的核苷酸序列。核酸探针技术具有专一性强、灵敏度高、快速、准确等特点。这些优势使其在生物大分子研究、药物分析、司法鉴定、临床疾病诊断和治疗等方面都发挥出巨大作用。
核酸探针作为20世纪80年代发展起来的第3代医疗诊断技术，不仅是研究核酸结构和功能的重要手段，还为传染病的诊断、流行性病的调查、食品卫生检查、肿瘤和遗传病的早期诊断等打开了一个新的突破口，并且是法医学研究的重要技术。根据分子信标记术科斯特赖克基斯(1999)建立了基因光谱分型检测技术，对决定人类对HVIZI敏感性的HIV辅助受体CCRS等位基因的突变进行了检测，对HVI的预防、研究具有重要的流行病学意义。
【图片】核酸探针示意图。
核酸探针的原理：生物体含有相对稳定的DNA序列，不易受外界环境因素的影响而改变。一般来说同种生物的DNA序列相同，不同种生物体DNA序列不同，生物个体都有自己独特的DNA序列。根据中心法则，DNA双链的核苷酸分子是通过碱基之间的氢键作用力专一性互补配对而结合在一起的，每个基因的RNA和对应的模板DNA链也可以通过碱基配对而结合在一起。核酸探针就是根据核酸分子之间的互补配对原则设计的一种检测目标DNA序列是否存在的一段核酸序列，探针与目标序列的这种结合称为杂交。一般先将探针核酸分子用某种可检测的物质标记，然后用探针去和待检测的序列杂交，如果探针与被检测的核酸分子之间存在互补性，则探针就会与目标序列形成杂交分子。通过检测是否存在标记物信号就可以知道是否存在目标序列。
核酸探针一般可分为2种类型：克隆探针和寡核苷酸探针。克隆探针 一般是通过分子克隆获得，包括基因组DNA探针、CDNA探针、RNA探针3种。
寡核苷酸探针 是人工合成的碱基数较少的DNA片段，属于短链探针。克隆探针一般较长，可标记的位点比寡核苷酸探针多，可获得较强的杂交信号，因此灵敏度较高；当靶序列存在，个别碱基与探针错配时杂交，仍可以发生，因此存在个别碱基差异的核苷酸序列不易被区分开。寡核苷酸探针的优点是对靶序列变异的识别能力，较强杂交时间短、可一次大量合成和成本低廉等优点；但是由于寡核苷酸探针序列较短，随机遇到互补序列的可能性大，所以特异性不如克隆探针。研究者可根据自己的具体情况选择合适的探针。另外根据探针分子结构，探针又可以分为单链探针(包括单链DNA探针、RNA探针和CDNA探针)和双链探针(双链DNA探针)。 核酸探针的制备，就是合成含有标记的核苷酸序列。常用的标记方法有2类：放射性同位素标记法和非放射性标记。常用的放射性同位素有32P、3H和35S等。放射性同位素标记的探针灵敏度较高，但由于半衰期限制，标记后存放的时间有限，另外对操作者和环境有放射性危害，因而近年来越来越多地被非放射性标记技术所取代。非放射性标记试剂种类丰富，包括金属、荧光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等。但是，许多研究者发现用生物素标记的探针不如放射性同位素标记的探针灵敏度高，所以放射性同位素标记的探针仍然是目前广泛选用的标记物。 探针的标记一般先制成含有标记物的脱氧核苷三磷酸dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，然后采用缺口平移法、末端标记法、随机引物法或聚合酶链反应法(PCR)等，技术将标记的脱氧核糖三磷酸dNTP掺人到核酸分子上。RNA探针的制备是先把DNA克隆于载体上，然后在RNA聚合酶的作用下合成含有标记的脱氧核苷三磷酸dNTP的单链RNA探针；CDNA探针的合成是首先提取生物的总RNA，用它作模板，在反转录酶的作用下合成放射性标记的CDNA探针。 核酸探针在生物领域的应用核酸探针，作为一种序列同源性的检测技术，已经成为植物基因组学和分类学研究的重要手段。目前，核酸探针在植物基因克隆、种质资源鉴定、植物分类学研究中都有重要的应用。在遗传诊断方面，通过检测某一病毒基因的缺失或碱基突变情况，疾病基因与另一非疾病基因的非随机关系，来确定某一遗传疾病是否存在。特别重要的是如果能够制作一系列遗传疾病基因的探针，就可以在胎儿出生前检测是否带有某种遗传疾病，减少患病婴儿的出生率。核酸探针还常用来产前胎儿性别鉴定。把当Y染色体上决定性别的特异序列做成探针时，就可以很轻松地提前检测到胎儿性别。当然这里存在伦理道德的问题，需要特别谨慎。在微生物感染性疾病诊断上，核酸探针应用非常活跃，如甲肝、腺病毒、EB病毒、艾滋病毒等的核酸探针已经建立，可以在临床上应用。作为一种简便快捷的检测手段，核酸探针技术必将为医学、生命科学、药物学等领域的研究工作带来极大的便利。 [1] 赵美萍,张新祥,常文保. 生化探针技术[J]. 大学学,2004,(02):8-16.
[2] 张明琴,窦远,张建华,宁中琰,陈吉宝. 核酸探针的原理及应用[J]. 生物学通报,2006,(07):11-12.
[3] 郑晶. 核酸探针信号转换及放大新方法研究[D].湖南大学,2015.
[4] 孟祥贤. 核酸探针的设计及其在疾病检测和酶学研究中的应[D].湖南大学,2007.
【图片】核酸探针示意图。
核酸探针的原理：生物体含有相对稳定的DNA序列，不易受外界环境因素的影响而改变。一般来说同种生物的DNA序列相同，不同种生物体DNA序列不同，生物个体都有自己独特的DNA序列。根据中心法则，DNA双链的核苷酸分子是通过碱基之间的氢键作用力专一性互补配对而结合在一起的，每个基因的RNA和对应的模板DNA链也可以通过碱基配对而结合在一起。核酸探针就是根据核酸分子之间的互补配对原则设计的一种检测目标DNA序列是否存在的一段核酸序列，探针与目标序列的这种结合称为杂交。一般先将探针核酸分子用某种可检测的物质标记，然后用探针去和待检测的序列杂交，如果探针与被检测的核酸分子之间存在互补性，则探针就会与目标序列形成杂交分子。通过检测是否存在标记物信号就可以知道是否存在目标序列。
核酸探针一般可分为2种类型：克隆探针和寡核苷酸探针。克隆探针 一般是通过分子克隆获得，包括基因组DNA探针、CDNA探针、RNA探针3种。寡核苷酸探针 是人工合成的碱基数较少的DNA片段，属于短链探针。克隆探针一般较长，可标记的位点比寡核苷酸探针多，可获得较强的杂交信号，因此灵敏度较高；当靶序列存在，个别碱基与探针错配时杂交，仍可以发生，因此存在个别碱基差异的核苷酸序列不易被区分开。寡核苷酸探针的优点是对靶序列变异的识别能力，较强杂交时间短、可一次大量合成和成本低廉等优点；但是由于寡核苷酸探针序列较短，随机遇到互补序列的可能性大，所以特异性不如克隆探针。研究者可根据自己的具体情况选择合适的探针。另外根据探针分子结构，探针又可以分为单链探针(包括单链DNA探针、RNA探针和CDNA探针)和双链探针(双链DNA探针)。 核酸探针的制备，就是合成含有标记的核苷酸序列。常用的标记方法有2类：放射性同位素标记法和非放射性标记。常用的放射性同位素有32P、3H和35S等。放射性同位素标记的探针灵敏度较高，但由于半衰期限制，标记后存放的时间有限，另外对操作者和环境有放射性危害，因而近年来越来越多地被非放射性标记技术所取代。非放射性标记试剂种类丰富，包括金属、荧光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等。但是，许多研究者发现用生物素标记的探针不如放射性同位素标记的探针灵敏度高，所以放射性同位素标记的探针仍然是目前广泛选用的标记物。 探针的标记一般先制成含有标记物的脱氧核苷三磷酸dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，然后采用缺口平移法、末端标记法、随机引物法或聚合酶链反应法(PCR)等，技术将标记的脱氧核糖三磷酸dNTP掺人到核酸分子上。RNA探针的制备是先把DNA克隆于载体上，然后在RNA聚合酶的作用下合成含有标记的脱氧核苷三磷酸dNTP的单链RNA探针；CDNA探针的合成是首先提取生物的总RNA，用它作模板，在反转录酶的作用下合成放射性标记的CDNA探针。 核酸探针在生物领域的应用核酸探针，作为一种序列同源性的检测技术，已经成为植物基因组学和分类学研究的重要手段。目前，核酸探针在植物基因克隆、种质资源鉴定、植物分类学研究中都有重要的应用。在遗传诊断方面，通过检测某一病毒基因的缺失或碱基突变情况，疾病基因与另一非疾病基因的非随机关系，来确定某一遗传疾病是否存在。特别重要的是如果能够制作一系列遗传疾病基因的探针，就可以在胎儿出生前检测是否带有某种遗传疾病，减少患病婴儿的出生率。核酸探针还常用来产前胎儿性别鉴定。把当Y染色体上决定性别的特异序列做成探针时，就可以很轻松地提前检测到胎儿性别。当然这里存在伦理道德的问题，需要特别谨慎。在微生物感染性疾病诊断上，核酸探针应用非常活跃，如甲肝、腺病毒、EB病毒、艾滋病毒等的核酸探针已经建立，可以在临床上应用。作为一种简便快捷的检测手段，核酸探针技术必将为医学、生命科学、药物学等领域的研究工作带来极大的便利。 [1] 赵美萍,张新祥,常文保. 生化探针技术[J]. 大学学,2004,(02):8-16.
[2] 张明琴,窦远,张建华,宁中琰,陈吉宝. 核酸探针的原理及应用[J]. 生物学通报,2006,(07):11-12.
[3] 郑晶. 核酸探针信号转换及放大新方法研究[D].湖南大学,2015.
[4] 孟祥贤. 核酸探针的设计及其在疾病检测和酶学研究中的应[D].湖南大学,2007.
