昆布二糖的制备方法

背景及概述^[1]

昆布二糖是β－1，3糖苷键连接的还原性二糖，是一种功能多样的高价值寡糖。它可以作为合成透明质酸的前体物质应用于制药及化妆品行业，作为促发芽剂和天然防腐剂应用于农业领域，且其具有益生作用，可以作为食品添加剂应用于食品保健品行业，另外，还可以调控嗜热菌热纤维梭菌的蛋白表达。昆布二糖的传统制备方法是以稀酸水解天然产物，但天然产物供应有限，导致昆布二糖价格居高不下。因此，开发成本低廉、环境友好的昆布二糖高效合成技术，对高附加值功能性寡糖生物制备具有重要意义。目前，昆布二糖的生产主要还是传统的稀酸水解松针或者昆布等多糖。该工艺过程产率低、分离提取成本高，导致昆布二糖的价格居高不下。昆布二糖还能利用化学合成进行制备，利用卤素糖基作为糖基供体，通过来源于Koenigs-Knorr方法的O糖基化获得昆布二糖。然而最终产品不容易纯化，最终得率低于10％。随着工业酶生物技术的发展，有科学家开始尝试酶法合成昆布二糖。日本科学家就利用3个酶(蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和昆布二糖磷酸化酶)，以蔗糖为底物生产昆布二糖，然而昆布二糖的得率只有50％左右，导致后续产品分离的成本较高。因此，亟待开发一种低成本，低污染，高得率的昆布二糖酶制备方法。

制备^[2]

通过体外多酶催化体系将淀粉和葡萄糖转化为昆布二糖的催化途径见图。

其中涉及的关键酶包括：(1)淀粉磷酸化酶(αGP，EC2.4.1.1)，用于从淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；(2)昆布二糖磷酸化酶(LBP，EC2.4.1.31)，用于催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖生成昆布二糖。高效液相色谱检测昆布二糖的浓度。取反应样品94.5μL，加入5.5μL10％的硫酸终止反应。离心取上清，采用HPLC检测昆布二糖出峰面积和峰高计算昆布二糖的浓度。因昆布二糖磷酸化酶有可能催化葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸生成纤维二糖，所以首先对所使用的昆布二糖磷酸化酶专一性进行鉴定。，昆布二糖保留时间为7.7-7.8分钟，与葡萄糖、磷酸出峰时间都不重叠，但与纤维二糖出峰时间相近，为了确定产物只有昆布二糖，而无纤维二糖，采用薄层层析色谱进行定性检测，标品纤维二糖和昆布二糖斑点位置并不重叠，可以进行定性检测，而反应液样品中出现与葡萄糖标品对应的斑点，与葡萄糖-1-磷酸标品对应的斑点，以及与昆布二糖标品对应的斑点，但是并未出现与纤维二糖标品对应斑点，由此可知，葡萄糖与葡萄糖-1-磷酸经该昆布二糖磷酸化酶催化并无纤维二糖生成，因此，可以用高效液相色谱进行昆布二糖定量。昆布二糖浓度与HPLC肌醇特征峰的响应强度成正比。昆布二糖响应强度逐渐增加，葡萄糖响应强度逐渐下降。经标准曲线斜率计算，昆布二糖的终浓度(图4A)是23mM，相对淀粉(10g/L，约61.3mM葡萄糖当量)转化率为37.5％。

主要参考资料

[1] 天津工业生物所在体外合成昆布二糖方面取得新进展

[2] CN201711014505.3一种制备昆布二糖的方法