人体胰脏多肽的应用

背景及概述^[1][2]

多种相关激素构成了胰多肽家族。人体胰脏多肽作为胰岛素提取物的污染物被发现并通过其来源的器官而不是功能重要性来命名(Kimmel等，Endocrinology83：1323-30(1968))。人体胰脏多肽是含有不同结构基序的36个氨基酸肽(SEQ ID NO：1)。随后在肠提取物中发现了相关的肽并由于N-和C-端酪氨酸将其命名为人体胰脏多肽(SEQ ID NO：2)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：2514-8(1982))。

已经报道了人体胰脏多肽肽发挥不同的生物学作用。人体胰脏多肽的作用包括胰腺分泌的抑制和胆囊的松弛。中枢给予的人体胰脏多肽产生通过局限于下丘脑和脑干的受体介导的进食的适度提高。

进食后产生人体胰脏多肽的释放。人体胰脏多肽的可替换分子形式是PYY(3-36)(SEQ ID NO：3)该片段构成人和犬小肠提取物中总人体胰脏多肽样免疫反应性的大约40％和禁食状态中总血浆人体胰脏多肽免疫反应性的约36％至进食后的略微超过50％。显然是人体胰脏多肽的二肽酰肽酶-IV(DPP4)分裂产物。

应用^[3]

人体胰脏多肽是由胰腺分泌的一种由36个氨基酸组成的多肽激素。人体胰脏多肽具有如下生理作用：(1)抑制胆囊收缩素和胰酶的排放，使胆囊平滑肌松弛，可降低胆囊内的压力，胆总管括约肌紧张加强，抑制胆汁向十二指肠的排放；(2)抑制餐后胰液和胆汁分泌，抑制胰泌素和胆囊收缩素等对胰腺分泌的促进作用；(3)在胃肠道中抑制五肽胃泌素引起的胃酸分泌；(4)抑制血浆胃动素的分泌，增加食管下括约肌的压力，抑制胃体部肌电活动。

一种可用于检测人体胰脏多肽的核酸适配体

1、合成以下序列所示人体胰脏多肽的随机单链DNA文库和引物：

随机文库RS35：5’-AGCGTCGGATACCACTACTA-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N代表A，T，G，C四个碱基中的一种)-ATCATGGAGTTCGTGGTCAG-3’；

5’引物：5’-FAM-AGCGTCGGATACCACTACTA-3’；

3’引物：5’-Biotin-CTGACCACGAACTCCATGAT-3’。

2、缓冲溶液的配制：

2.11×BindingBuffer(pH＝7.35)的配制：分别称取2.383gHEPES，3.510gNaCl，0.186gKCl，以及0.203gMgCl2·6H2O溶解于200mL灭菌水中，调节pH值至7.35，加水定容至500mL得到1×BindingBuffer，其中HEPES的浓度为20mM，NaCl的浓度为120mM，KCl的浓度为5mM，MgCl2的浓度为2mM，然后将1×BindingBuffer于4℃冰箱中保存。

2.2浓度为20mM的PBS溶液(pH＝7.5)的配制：称取0.2940gNaH2PO4·2H2O，2.8960gNa2HPO4·12H2O，4.390gNaCl加灭菌水至200mL，调pH至7.5，定容于500mL容量瓶，4℃保存。

2.3浓度为200mM的NaOH溶液的配制：称取0.800gNaOH，加少量灭菌水溶解，定容于100mL容量瓶，4℃保存。

2.4抗体孵育液(20mMPBS，0.05％Tween-20，pH＝7.5)的配制：称取0.2940gNaH2PO4·2H2O，2.8960gNa2HPO4·12H2O，4.390gNaCl加灭菌水至200mL，加入50μLTween-20，调pH至7.5，定容于500mL容量瓶，4℃保存。

2.5浓度为30mM的PBS溶液(pH＝7.4)的配制：称取0.0889gNaH2PO4·2H2O，0.8699gNa2HPO4·12H2O，1.7532gNaCl，加灭菌水至60mL，充分溶解后，定容于100mL容量瓶，4℃保存。

3、GO-SELEX筛选获得人体胰脏多肽特异核酸适体文库，原理如图1所示：

3.1随机文库预处理：将装有5nmol随机文库RS35的离心管置于离心机中，在9000g下离心10min，小心取出离心管，避免晃动，迅速加入400μL的1×BindingBuffer，将离心管置于95℃下加热5min后，立即取出并冰浴5min，再取出置于室温下维持5min得到预处理后的随机文库。

3.2孵育：用50μL的1×BindingBuffer溶解200μg人体胰脏多肽干粉得到人体胰脏多肽溶液，将人体胰脏多肽溶液加入到步骤3.1中预处理后的随机文库中，在37℃下孵育2h。

3.3解离：孵育完成后加入氧化石墨烯分散液(氧化石墨烯分散液的终浓度为30μg/mL)，在25℃下吸附25min，然后在20800g下离心10min，收集上清，即为筛选所得人体胰脏多肽的特异核酸适配体文库。

4、进行PCR扩增文库：取100μL筛选所得的人体胰脏多肽特异核酸适配体文库进行常规PCR扩增，扩增条件为：94℃下预变性10min，94℃下变性30sec，56.9℃下退火30sec，72℃下延伸30sec，循环10轮，最后在72℃下最后延伸7min。轮筛选后需将全部所的人体胰脏多肽特异核酸适体文库预扩增10个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。

5、制备DNA单链文库：将200μL链霉亲和素修饰的琼脂糖微球2200g离心去上清，再用500μLPBS洗涤，离心去上清；重复洗涤两次。将步骤3中PCR扩增所得的扩增产物与琼脂糖微球在常温下孵育半小时，通过扩增产物上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面。然后2200g离心去上清，用PBS离心洗涤三次；再加入200mMNaOH溶液500μL至琼脂糖微球中用于双链DNA的变性处理，常温反应15min，2200g离心5min，收集上清；除盐柱用10mL无菌水洗涤后，加入碱变性后收集得到的上清液，自然滴完。加入1mL无菌水，收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库。

6、重复筛选：将步骤5得到的DNA单链文库替代步骤3中的随机文库，重复上述步骤3～5所示的阳性筛选、PCR扩增及制取单链DNA文库过程，重复4次。

7、阴性筛选：在第五轮筛选及以后，以人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白为对照，将步骤5后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为：将人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白干粉溶解于缓冲溶液中，然后与步骤5后筛选得到的DNA单链文库孵育；然后加入含有氧化石墨烯的缓冲液进行孵育，经离心弃去上清，再加入缓冲溶液将氧化石墨烯重新分散均匀，收集此时的氧化石墨烯溶液。

8、多轮筛选：将步骤7所收集的氧化石墨烯溶液替代步骤6中的DNA单链文库，继续重复进行上述步骤6～7的操作过程，在轮筛选以后，用于孵育筛选的文库量约为500pmol，从第三轮筛选开始，靶标与随机文库的比例开始下降，比值从10下降至1；重复筛选过程中用荧光光谱仪监测所得DNA单链文库对人体胰脏多肽识别能力的增强情况，直至18轮筛选后DNA单链文库对人体胰脏多肽的识别能力满足要求，将所得产物经高通量序分析。对测序结果整理分析后，最终可得到富集度高的七条序列：Q10、Q11、Q12、Q13、Q14、Q16、Q17，这七条序列即为可用于检测人体胰脏多肽的核酸适配体。

主要参考资料

[1] 欧玉静, 王晓梅, 李春雷, & 朱亚龙. (2017). N-甲基吡咯烷酮的应用进展. 化工新型材料, 45(8), 241-243.

[2] 张军, & 唐建兴. (2011). N-甲基吡咯烷酮合成技术分析. 合成技术及应用, 26(4), 19-23.

[3] 贾太轩, 姜雄华, & 冯世宏. (2004). N-甲基吡咯烷酮的最新研究进展. 辽宁化工, 33(11), 642-644.