小鼠气管和支气管组织提取物的应用

背景^[1-4]

小鼠气管和支气管组织提取物分离自小鼠气管和支气管组织，可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。气管trachea和支气管bronchi均以软骨、肌肉、结缔组织和粘膜构成。软骨为“C”字形的软骨环，缺口向后，各软骨环以韧带连接起来，环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接，保持了持续张开状态。

管腔衬以粘膜，表面覆盖纤毛上皮，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空气中的灰尘颗粒，纤毛不断向咽部摆动将粘液与灰尘排出，以净化吸入的气体。气管壁自内向外由粘膜层、粘膜下层及外膜组成。粘膜层有纤毛上皮，为假复层纤毛柱状上皮，夹有杯状细胞。上皮基膜明显，固有膜内有丰富的弹性纤维、淋巴组织和浆细胞，纤毛可向咽喉方向摆动，将尘粒与细菌等随粘液一起运到咽，经咳嗽反射排出。

粘膜下层为疏松结缔组织，内有气管腺，开口于粘膜表面，上皮和腺体的分泌物是防止尘埃入肺的保护装置，分泌物中含有各种免疫球蛋白，具有抑菌和抗病毒的作用，是机体防御系统的组成部分。外膜由14～16个“C”字形透明软骨环和环间的结缔组织构成，软骨环的缺口朝向后面，缺口之间有平滑肌束及弹性纤维构成膜性壁。软骨起支架作用，有弹性，可使管腔保持开放状态，以维持呼吸功能的正常进行。平滑肌和弹性纤维可使管壁有一定的舒缩性，适于其后方的食管腔内食团顺利下行及颈的俯仰动作。

应用^[5]

小鼠气管和支气管组织提取物可用于TDI哮喘气道炎性反应中TSLP的作用及其调控机制研究：

1.采用气管滴注的方式进行激发给药,改进TDI哮喘小鼠模型建立的方案,并对模型的建立进行评价。2.观察TDI哮喘过程中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因m RNA表达及其启动子区甲基化变化,探讨TSLP及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘发病中的作用。3.观察TSLP中和抗体干预对TDI哮喘的治疗作用以及TSLP与Th17/Treg细胞平衡间的相互作用,探讨TDI哮喘的发病机制。方法:

1.动物模型的建立选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠20只,适应环境1周后,随机分为TDI哮喘组(TDI组)和溶剂对照组(AOO组)。TDI组小鼠于第1、8天耳背分别涂抹20μL 0.3%TDI致敏(溶剂为丙酮:橄榄油=2:3),第15天采用气管滴注法给予20μL 0.01%TDI进行激发(溶剂为丙酮:橄榄油=1:4)。AOO组小鼠,按照上述方法给予等量的溶剂。两组小鼠在同样的饲养条件下饲养并观察小鼠一般生长状况,每天测量小鼠体重。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类计数并将BALF中炎细胞涂片,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF白细胞介素4(IL-4)和IFN-γ水平的变化,每组另取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺组织苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学改变。

2.TSLP表达及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘中的变化及其相关基因启动子区甲基化改变模式选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠32只,适应环境1周后,随机分为TDI组和AOO组。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠检测BALF中细胞总数和细胞分类计数,每组各取4只多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺组织HE染色观察气管和肺组织病理学改变。每组各取6只小鼠部分肺组织,实时荧光定量逆转录RT-PCR和Mass Array飞行质谱法分别检测TDI组和AOO组小鼠肺组织中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因mRNA和基因启动子区甲基化水平。

3.TSLP中和抗体干预对小鼠TDI哮喘的保护作用选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠48只,适应环境1周后,随机分为TDI组、AOO组和TSLP中和抗体干预组(TSLP中和组),TDI组小鼠于第1、8天耳背分别涂抹20μL0.3%TDI致敏,(溶剂为丙酮:橄榄油=2:3),第15天采用气管滴注法给予20μL 0.01%TDI进行激发(溶剂为丙酮:橄榄油=1:4)。TSLP中和组在激发前30min给予TSLP中和抗体腹腔注射(15mg/kg),AOO组小鼠,按照上述方法给予等量的溶剂。

三组小鼠在同样的饲养条件下饲养并观察小鼠一般生长状况。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠血清检测Ig E水平的变化,同时取肺组织匀浆测IL-4、IFN-γ、IL-13的变化水平,每组各取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后HE染色观察三组小鼠气管和肺组织病理学改变,每组各取6只小鼠的部分肺组织Western blot检测TSLP蛋白的表达水平,其余部分肺组织用实时荧光定量逆转录RT-PCR法分别检测肺组织中ROR-γt、Foxp3、IL-17A基因m RNA。

参考文献

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[2]Phosphatidylinositol 3-kinases pathway mediates lung caspase-1 activation and high mobility group box 1 production in a toluene-diisocyanate induced murine asthma model[J].Junjie Liang,Haijin Zhao,Lihong Yao,Haixiong Tang,Hangming Dong,Yue Wu,Laiyu Liu,Fei Zou,Shaoxi Cai.Toxicology Letters.2015(1)

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[5]王晓群.TDI哮喘气道炎性反应中TSLP的作用及其调控机制研究[D].济南大学,2017.